全6件 ( 1 〜 6 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.1448-6 - 2008/06/30 (月) 12:55:00 - μ 皆さん、アドバイスありがとうございます。 相同組み換え体かを判断するのに最終的にはサザンに持っていくつもりではあったので、おおさんの仰るとおり、ここでもたついていても実りは少ないですね。 念を入れて･･･と考えすぎていたかもしれません。 とりあえず、プライマーは数組ありますので、ラボにあるPrime STAR、他いくつかの酵素を試しつつ、サザンの準備も進めていこうと思います。

(無題) 削除/引用 No.1448-5 - 2008/06/30 (月) 09:53:43 - Caspase 私もサザンを行うことを強くお勧めします。 short armを対象としたPCRの結果とサザンの結果が一致していれば次回からshort armのPCR(→必要なクローンだけサザンをやると確実)だけでよいでしょう。 勿論、PCRコントロールは必須です。 今後どのような実験をされるのかは定かではありませんがここのスクリーニングがしっかりしていないと後々面倒なことになります。特にノックアウトなどの場合は(私の経験に基づきます。笑)。

(無題) 削除/引用 No.1448-4 - 2008/06/29 (日) 13:25:33 - おお 私もサザンで良いと思う。てか、PCRだけでけつろんずけていいの ? 長いためにPCRが難しく、適切なポジコンもないのであればいつまでたっても結論が出ない可能性のほうが大きいのでは。 PCRをしたいというのであれば、プライマーは確かに長め(35マーとか)のほうがいいでしょうね。あとは一般的なことしかアドバイスできませんが、ベタインいれてみたらとか、違う酵素使ってみたら(ほっとスタートようのものとかふくめ)、タッチダウンでやってみたらとか、、、KODはベタイン入れるとよくかかる酵素という印象があります。

(無題) 削除/引用 No.1448-3 - 2008/06/29 (日) 09:45:52 - ~ 材料がマウスやヒトであればプライマーは短めですね。 もっと長くしてもいいのでは。 ラボに他にポリメラーゼがあれば、全部試してみてはどうですか。 相同組換えを起こしたかどうかであれば、 サザンの方が確実では？ 増えるかどうかわからないPCRよりも、結果がはっきりします。

(無題) 削除/引用 No.1448-2 - 2008/06/29 (日) 09:14:59 - MP 質問の答えにはなっていないかもしれませんが、相同組み換えのスクリーニングの場合、short arm側のPCRで十分ではないでしょうか？ あとはサザンで確認すればいいのでは。 PCRに関しては酵素やprimerを変えるのも手かと思います。 経験上、genomic PCRではKODよりもTakaraのPrimeSTAR, LA taqあたりのほうがよい気がします（けっしてTakaraの回し者ではありませんが）。

ゲノムPCRで困っています。 削除/引用 No.1448-1 - 2008/06/28 (土) 15:55:48 - μ いま、ゲノムPCRにトライしています。 目的は、遺伝子相同組み換え体のスクリーニングです。 細胞から抽出したgDNAをテンプレートに約10kbをターゲットとしてPCRを行っています。 導入遺伝子のショートアーム側（約4kb）は検出できたのですがロングアーム側のPCRで未だ目的のバンドを得られません。 PCR酵素はKOD plus,KOD FXを使い、長め（27mer）のプライマーでシャトルPCRを行っています。一部GCリッチな配列も含まれるので反応系に5％DMSOを添加していますが、スメア＋5kb以下のバンドが複数出るのみです。 ロングアーム側の相同組み換えが起こっていないとも考えられますが、自分の手技の未熟さゆえにうまく検出できていないだけでは？？とも思われます。できるだけ適正なPCR条件を見つけたいのですがゲノムPCRを行う上で、何かアドバイスやコツなどご教授願えたら、と思います。

全6件 ( 1 〜 6 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---