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(無題) 削除/引用 No.1443-6 - 2008/06/29 (日) 02:11:07 - おお >[Re:5] qうぇrtさんは書きました : > 一回膜貫通くらいなら大丈夫ですよ。 > 沈殿してしまうのは膜輸送をするような１２回貫通とかのタンパク質の場合が多いです。 そうとはいい切れないようです。まくをたしか3回貫通するあるたんぱく質(30kDa前後)は、そのホモログ(同様に30kDa前後)と相互作用し、サンプルバッファーで処理、SDSPAGEで観察すると60kDaのところに両者がcoマイグレートし,ボイルすると、その割合がおおくなります。1回貫通でも、疎水的な領域で相互作用しているパートナーがあればアグル可能性があると思います。 この場合は沈殿はしません。

(無題) 削除/引用 No.1443-5 - 2008/06/28 (土) 17:40:43 - qうぇrt 一回膜貫通くらいなら大丈夫ですよ。 沈殿してしまうのは膜輸送をするような１２回貫通とかのタンパク質の場合が多いです。

(無題) 削除/引用 No.1443-4 - 2008/06/28 (土) 02:07:21 - おお > 私もそう思います。一応気に止めておく程度でまずはいいと思います。 > 逆にIPする前のライセイトをサンプルバッファーで処理(ボイル)しSDSPAGEした時にバンドが期待したところ、あるいは公表されているデーターと同じ場所に出ているようであれば、IP後の処理もまずは一緒でいいかと思います。ビーズからのはがすのであれば高濃度のSDSでかなりものがはがれます。6M程度の尿素も使えると思います。 その他にも外す方法はありますが、後のSDSPAGEにコンパティブルではありませんのでワンステップ追加しないといけないので触れていません。詳しくは"antibody, a laboratory manual"などをお読みください。

(無題) 削除/引用 No.1443-3 - 2008/06/28 (土) 01:12:17 - おお >[Re:2] りょうさんは書きました : > 膜貫通蛋白でもboilしてアグルのは一部の分子種ではないでしょうか。 > そういった蛋白に当る可能性の方が低いくらいだと思います。 > 私もそう思います。一応気に止めておく程度でまずはいいと思います。 逆にIPする前のライセイトをサンプルバッファーで処理(ボイル)しSDSPAGEした時にバンドが期待したところ、あるいは公表されているデーターと同じ場所に出ているようであれば、IP後の処理もまずは一緒でいいかと思います。ビーズからのはがすのであれば高濃度のSDSでかなりものがはがれます。6M程度の尿素も使えると思います。

(無題) 削除/引用 No.1443-2 - 2008/06/27 (金) 23:28:22 - りょう 膜貫通蛋白でもboilしてアグルのは一部の分子種ではないでしょうか。 そういった蛋白に当る可能性の方が低いくらいだと思います。 37度１時間とか、70度10分でも解離するのではないでしょうか。 total lysateを複数の条件で処理して１枚のゲルに流して予備実験されてはどうでしょうか。 運が悪くない限り１回貫通蛋白ならboilしても大丈夫かなあって思います。 逆に運が悪ければ細胞質蛋白でもアグルものはアグルでしょう。

膜蛋白をIPした後、ビーズから分離するときのボイル 削除/引用 No.1443-1 - 2008/06/27 (金) 23:03:53 - 分子生物初心者 いつもお世話になっております。 ひとつ質問させてください。 現在、一回膜貫通蛋白をwestern blotしております。 ここの過去のトピックで膜蛋白はボイルをするとアグると拝見いたしました。 これから初めてその膜蛋白に対する抗体で免疫沈降しようと思っています。 protein-A sepharose beadsを用いる予定でして、washの後、beadsから抗原抗体複合体を離す際に2MEやSDSの入ったsample bufferを加えた後、3分100℃でボイルしてしまってもいいのでしょうか？ 通常の細胞質蛋白はIPの後、3分100℃でボイルしています。 しかし、膜蛋白をIPしたい場合には3分100℃でボイルするとアグってしまいますよね？ なるべくユルい条件でビーズから離す事はできないのでしょうか？ 通常のwhole lysateは膜蛋白ですので、70℃, 10 minで処理しています。 膜蛋白のビーズからの分離の条件をご教示くださいませんでしょうか？どうぞ宜しくお願いいたします。

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