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(無題) 削除/引用 No.1437-11 - 2008/06/29 (日) 15:03:04 - ~ 時間も濃度もケースバイケースで決めています。 途中でチェック用に流してみて、切れが悪ければ酵素を追加するときもあります。 自分で切り出し用のプラスミドをO/N処理するときはありますが、 後輩にはやらないように言います。 >よくない場合、具体的にどういうことがおこるんでしょうか？ 酵素を多めに入れたりO/N処理して、何も悪影響が無かった場合もありますが、 バンドが消えた(細切れになった) ラダーになった のを見たことはあります。 >結局コロニーを拾う数が増えるだけで、そんなたいした問題でもないように思うんですけどどうですか？ 4個拾うところが、8個拾うことになって、制限酵素→電気泳動で分かるというのが事前に分かっていれば、たいした問題ではないでしょう。 問題なのは、どれだけのコロニーを拾って、どのようなチェックで問題が起きたことを確認できるのかが事前に分からないことです。 ようやく増やしたPCR産物がずたずたになって、もう一度PCRかけたらぜんぜん増えないというのであれば、困ったことになるでしょう。 >結構、変わった条件で測定していて、判断に迷うときがあります。こういうとき10unitで切ろうと思うんですけど、どう思われますか？ インサート1ugあたり10unit入れるということについては、別に構わないと思います。 ただ、後輩にやらせるのであれば、朝から始めさせて、 2,3時間ごとに電気泳動して切れたかチェックさせます。 PCRフラグメントなどで切れたか分からない場合は、まずは数時間でライゲーションさせます。 それで取れてこないようであれば、一度Tベクターに入れさせます。

(無題) 削除/引用 No.1437-10 - 2008/06/29 (日) 14:07:49 - おお ユニット的にはあまり気にしてませんね、みなさんと同様です。時間は確かに精製の度合いとか、ヌクレアーゼのコンタミが怖い時は確かに短時間で済ましたいと思いますが、そのほかの場合はEcoRI以外であればO/Nはすることがあります。でも、やはりその日のうちに次のステップに行くか凍らせる法が安心するのでそっちを選ぶ確率が高いです。

(無題) 削除/引用 No.1437-9 - 2008/06/28 (土) 17:28:55 - プラスミド オーバーナイトで切ると、単純に一日遅れるから、という理由でやりません。。。 その日のうちにトランスフォーメーションまでたどり着けないときや、電気泳動すらできないときは、１時間くらい切った後、凍らせて保存してます。 酵素の量も２０マイクロリットルに１−２マイクロと、ユニット無視でやってます。 電気泳動でちゃんと切れてるかわかりますから。

(無題) 削除/引用 No.1437-8 - 2008/06/28 (土) 15:12:22 - カナマイシン 私は精製度によって分ける派です。 例えば、アルカリSDS法でちゃちゃっと取っただけのヤツだったり、 しかもホストがプラスミドプレップ用にしっかり確立されていなくて ヌクレアーゼアタックが心配だったりする場合は一終夜など長時間の切断は極力避けます （昔は平気でやっていたのですが、 　やって痛い目を見ることが何度かあったので避けるように適応しました）。 ここまでは他の皆様と同じ意見なのですが、ひとつ、ちょっとオリジナルで気にしてることが。 長時間切断する際には、37˚C環境は、温浴でなくエアーインキュベーターを使ってます。 温浴を使うと エッペンのフタ部分が外気に触れて冷える →水滴付く →制限酵素反応液が濃くなる →スター活性その他が心配 と考えていますので。 実際、エアーインキュベーターの方が失敗が少ない気がします。 そもそもそんなに失敗もしないんですが…

(無題) 削除/引用 No.1437-7 - 2008/06/28 (土) 13:52:33 - りょう まず最初に、私の方法は手荒ですが問題は起きません。 1-5マイクログラムのDNAに10-20unitの酵素を入れて最低２時間・最高O/Nで行っています。バッファー塩濃度が同じならdouble digestでしかもCIAPも1マイクロリットル同時に入れてます。 これまで20種類くらいの酵素を扱ってきましたが、O/N消化やdoubleで入れたことが原因でトラブルになったことはありません。 結果が悪いのは他の工程に問題があると思います。

(無題) 削除/引用 No.1437-6 - 2008/06/28 (土) 13:04:38 - なまぐさ酵素職人 別に問題ないと思いますよ。 決まった配列しかきらないから、制限酵素は優秀なんです。 決まった配列以外をきったら、制限酵素の価値はないじゃないですか？ 私は、土曜に制限酵素を入れて月曜まで３７度で放置したこともあります。 このときは全然問題ありませんでした。

(無題) 削除/引用 No.1437-5 - 2008/06/26 (木) 23:27:34 - う〜んと 別のプラスミドから切り出すインサートだと、元のプラスミド溶液の精製度が悪くてDNaseが残ってることもあると思います。 なのでOvernightは避けたいです。 O/Nでやるくらいなら30分だけ切るほうがずっといいですね。

(無題) 削除/引用 No.1437-4 - 2008/06/26 (木) 20:51:00 - 中年 私も定義量の10倍程度は入れることが多いですね。ただ、そういう場合はovernightでインキュベートすることは避けます。いくら精製してある酵素標品だと言っても、それを完全消化後の基質ゼロの状態で37℃に置いておくというのが生理的に許せません。まあ、ほとんどの酵素はクローン化されて大量発現されているのでしょうから、他の活性のコンタミは無視できるレベルなのでしょうが。

(無題) 削除/引用 No.1437-3 - 2008/06/26 (木) 20:41:47 - AP 制限酵素過剰、反応時間過剰はスター活性の原因になる可能性があります。 スター活性が起こると、電気泳動でチェックしたとき、余計なところで切れて短くなったバンドが出てラダーになったり、スメアになったりします。 逆に、このような結果にならなければ、過剰でも問題なしです。 DNAの精製度が低いと切れにくくなるし、cccだと効きにくい酵素があったりして過剰に入れたほうが良い場合もあるし　一本だけ反応するのに1 unitで十分でも、それだけ取るために10 units/uLの酵素を希釈してあまりを捨てるのもばからしいので1 uL、10 unitsを入れたり、普段から過剰することは多いですが、大丈夫なもんですよ。むしろ切れのこりがあった方が実験に支障がでるので、私は最初から10倍くらいは過剰に入れることが多いです。

(無題) 削除/引用 No.1437-2 - 2008/06/26 (木) 19:12:46 - Pumpkin 過去ログを検索してみてください。末端の配列や酵素の種類によるところが大きいと思います。一概に10uが良い悪いではないとおもいます。

制限酵素 削除/引用 No.1437-1 - 2008/06/26 (木) 19:10:37 - dog ベクターにインサートを入れる際に制限酵素でインサートを切断することがありますよね？この際にインサート1ugに酵素10unit入れて37℃でovernightで切るのはよくないんでしょうか？普通は1unitとか酵素を減らすように思うんですけどどうなんでしょうか？また、よくない場合、具体的にどういうことがおこるんでしょうか？一部のインサートが悪くなるだけなら、結局コロニーを拾う数が増えるだけで、そんなたいした問題でもないように思うんですけどどうですか？ちなみに10unitを使う必要性なんですが、末端の切断の場合切れにくい配列ってありますよね？NEBの資料を見ても、結構、変わった条件で測定していて、判断に迷うときがあります。こういうとき10unitで切ろうと思うんですけど、どう思われますか？

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