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(無題) 削除/引用 No.1436-9 - 2008/07/09 (水) 04:44:02 - 名無し トランスサイレインは肝臓でつくられる血漿蛋白質として昔からよく知られていて、これが原因で起こる人の有名な病気もあって、血漿を使ってその病気の診断もしてますから、（少なくとも健康なひとなら）人には無いということはまずないとおもいます。可能性として、抗体をつくるとき血漿からの抗原の精製が不十分で他の血漿蛋白質に対する抗体も出来てしまい、それがまじっていて、いろんな血漿蛋白質と反応してる可能性はあるような気がします。もしそうなら抗原カラムで抗体を精製するかすれば良くなる可能性はあるとおもうけれど、モノクロとかモノスペシフィック的な精製ポリクロを買うほうがいいとおもう。病理とか臨床でも使われてるから実績のある抗体を探すのは容易とおもう。

(無題) 削除/引用 No.1436-8 - 2008/07/07 (月) 22:25:17 - えー > 抗体の説明書には、コントロールとしてHuman plasmaから精製したトランスサイレチンとHuman plasmaをウエスタンしたフィグがでていました。 > それで、こちらでもHuman plasmaを用意し、ウエスタンを行ったのですが非特異的なバンドしか現れませんでした。 > 　精製したトランスサイレチンを購入してウェスタンしてみるのは？ 抗体の生死の判断や、Igが悪さをしている可能性を確認できるのでは？ （抗体を買うほうが安いかもしれませんが、今後も安定してポジコンを出すために、精製品を試してみるのもいいのでは） 　ウェスタンの手技に問題は無いとしたうえで、 たまたま使用したhuman plasmaにはトランスサイレチンが存在しない （検出限界以下）ということを証明した　という解釈はダメですか？ 　失敗したのではなく、存在しないことを確認したんだ！っと前向きに、ある意味では現実逃避的に解釈してみました。

(無題) 削除/引用 No.1436-7 - 2008/07/07 (月) 20:01:54 - TTR そうですね。 血漿中のIgGに二次抗体が反応してバンドが現れているかもしれません。 二次抗体のみを反応させて、バンドがでるようであれば血漿中のIgGを除去することを考えます。 でも除去した側にトランスサイレチンがいってしまったら最悪なんですけどね・・・・。

内在性IgGはOKですね。 削除/引用 No.1436-6 - 2008/07/04 (金) 19:25:09 - 名無し IgGと２次抗体が反応している可能性はクリアという事でよろしいでしょうか。血漿だとIgGはすごいあるから、たとえ種が違っていて反応しないはずでも出るときは出ます。それに糖鎖とかついてたり分解したりして結構ヘテロで、バシッとH,Lの２本という感じじゃなくてそれ以外にもIgG由来のいろんなバンドが出てきて汚くなることがあります。

(無題) 削除/引用 No.1436-5 - 2008/06/28 (土) 15:32:30 - TTR 先ほどの追記で抗体は今月入手しました。−２０℃できたので氷上でゆっくり解凍し、解凍後は４℃で保存してます。 このため抗体がだめになっていることは考えにくいです。

(無題) 削除/引用 No.1436-4 - 2008/06/28 (土) 15:29:30 - TTR 抗トランスサイレチン抗体はAbFRONYIERの抗体を使用しています。 ブロッキングペプチドはありません。 抗体の説明書には、コントロールとしてHuman plasmaから精製したトランスサイレチンとHuman plasmaをウエスタンしたフィグがでていました。 それで、こちらでもHuman plasmaを用意し、ウエスタンを行ったのですが非特異的なバンドしか現れませんでした。

(無題) 削除/引用 No.1436-3 - 2008/06/26 (木) 21:29:21 - 名無し 抗体がダメになってくるとそういうことが起こることがある。時間がもったいないので、抗体を買い替えた方がいいと思う。

(無題) 削除/引用 No.1436-2 - 2008/06/26 (木) 17:22:05 - 通りすがり 抗トランスサイレチン抗体のメーカー名やcatalog numberをお知らせください。 ブロッキングペプチドはありますか？

抗トランスサイレチン抗体でのウエスタンブロット 削除/引用 No.1436-1 - 2008/06/26 (木) 16:13:21 - TTR ウエスタンブロットで血漿サンプル中のトランスサイレチンを検出したいのですが、抗トランスサイレチン抗体を反応させた後、露光するとたくさんのバンドが検出されてしまいます。 このバンドの中にトランスサイレチンの分子量１５KDaのバンドはありません。 どのようにしたらうまくトランスサイレチンを検出できるでしょうか？ 条件を以下に書きます。 ヒト血漿サンプルを電気泳動で分離、PVDFに転写後、スキムミルクでブロッキング(2hr)。 抗トランスサイレチン抗体を反応させる(4℃、一晩)。洗いを行った後、二次抗体を反応させる(室温、1時間)。その後、試薬を反応させて、ポラフィルムに露光させる。 アドバイスよろしくお願いします。

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