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(無題) 削除/引用 No.1426-11 - 2008/06/26 (木) 00:46:11 - MIHO アドバイス、ありがとうございます！ これまでメンブレンが黒くならない場合(バンドが確認できた場合)でも バンドが薄いのが気になって、プローブを濃い目に作った上に プロトコルよりも量を多めにして実験を行っていました。 ここにも問題があるのかもしれないですね。 アドバイスを元に、また詳しく調べ直してみます。 それでも解決しない部分があれば書き込ませて頂きます。

(無題) 削除/引用 No.1426-10 - 2008/06/25 (水) 23:54:25 - AP >キレイに上半分だけが黒くなるんですけど。。 他の原因がないとも限りませんが、これはバッファが汚染されているときの典型です（どうしてそうなるかは先に説明したとおり）。 >後は斑に黒くなってしまいました。 まだらにバックがでるのはまた別の理由です。ハイブリ時のプローブのあたり方のムラ、抗体反応時の抗体のあたりムラ、発色液のあたりムラが考えられます。 それそれ、濃度が濃すぎるとなりやすいですし、当てる瞬間の時間差、濃度差の場合もあるし、インキュベート中のあたりムラということもあります。 一番起こりやすいのはハイブリムラですが、プローブの濃度を薄め（10 ng/mL以下）にして、長時間（オーバーナイト）でハイブリするときれいに行きやすいです。ラピッドハイブリのシステムを使うときは、ハイブリ時間を長くしすぎないようにしましょう。 ドット状にバックが現れるのは、抗体、プローブの凝集物が混じっているとか、ホコリ、グローブの汗取り粉、発色剤の凝集物、発色バッファ中のMgの析出物の可能性があります。 性質の違うバックグラウンドがその時々出ているのを、ひとくくりに同じ問題にしているように見受けられますが、いろいろな操作毎の複合的な問題のようです。 Rocheから配布されているDIG filter hybridizationのハンドブック（download版もあり）に、いろいろなパターンのバックグラウンドの問題も含め、失敗例とトラブルシュートのポイントが出ているので、良く読んで検討してみてください（間違いなく、こういう場で聞くより多くの有用な情報が得られるはず）。それでも改善しなかったら、具体的な問題を質問していただければ、ピンポイントのアドバイスは出来るかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1426-9 - 2008/06/25 (水) 23:15:46 - MIHO そうなんですか！？ キレイに上半分だけが黒くなるんですけど。。 今日のサザンの結果は、コントロールはバンドが見えたのですが、 後は斑に黒くなってしまいました。 やはりバッファーは未使用ではなかったと思います。

(無題) 削除/引用 No.1426-8 - 2008/06/25 (水) 21:54:04 - AP >同じ使用済み(?)バッファーを使って電気泳動を行い 汚染されたバッファを使っても、使っているプローブがその都度違っているわけですから、バックが出るときも出ないときもあるでしょう。 でも基本的には、核酸で汚染されればクロスハイブリでバックがあがるリスクが非常に高くなるので、クリーンな条件で行うべきです。 >サザンのバンドの検出を確認できる場合とメンブレン全体（または上半分） この上半分というバックは、泳動バッファの汚染でほぼ確実じゃないかと思います。

(無題) 削除/引用 No.1426-7 - 2008/06/25 (水) 20:19:02 - MIHO 泳動用のバッファーについては、 今後サザンを行なう時には注意します。 友人は、DIGの量を1.5倍にしていたのを1倍にしたら、 黒くならなくなった気がするとのことでした。 けれど、私は1.5倍にしたことはないので、 DIGの量が黒くなる原因では無いと考えています。

(無題) 削除/引用 No.1426-6 - 2008/06/25 (水) 19:58:02 - Pumpkin APさんのご質問はごもっともで少なくとも解決の一つとして、バックがあがるあがらないに関係なく、再利用の電気泳動バッファを使うことは賛成できません。 もちろん、EtBr染色で制限酵素消化断片を確認したりPCRで増幅されたかなどの確認には全く問題ないですし、バッファの節約という意味からもむしろすべきだと考えています。しかし、高感度に検出しようというサザンの類ではバックもあがりますし、予想もしないバンドが出てきた時の解釈に無駄な時間が費やされるだけです。フラグメントをクローニングしようというときも然りだと思います。

(無題) 削除/引用 No.1426-5 - 2008/06/25 (水) 19:51:23 - MIHO 未使用の時と未使用でない時があります…。 どちらの場合に黒くなっているかは分かりませんが。 ここでよく分からないのが、 同じ使用済み(?)バッファーを使って電気泳動を行い 同じサザンのバッファーを使って実験を行った場合に、 私のメンブレンは黒くなり、友人のメンブレンは黒くならない という場合もあるんです。 どの課程でふたりに違いが出ているのかが分からなくて、 解決しないままなのです。

(無題) 削除/引用 No.1426-4 - 2008/06/25 (水) 19:19:07 - AP いろいろ可能性があるとは思いますが、まずこれだけ確認させてください。 サザンブロットをしようというとき、電気泳動のバッファは未使用のものを使っていますか？ 使いまわしだと、前に流したDNAでバッファが汚れ、ゲル全体に、あるいは陰極側からゲル内に流れ込んで、陰極側から汚れが移ります。たとえばプラスミドを流したバッファを再使用して電気泳動をしてブロットすれば、プローブにプラスミドの配列が混じってたりすると、汚れたところが反応します。

(無題) 削除/引用 No.1426-3 - 2008/06/25 (水) 18:51:09 - MIHO 0.2mL/L Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments を使用しています。

(無題) 削除/引用 No.1426-2 - 2008/06/25 (水) 18:33:31 - ~ せめて何を使って検出しているのかを… 深紫ということは、DIGで発色でしょうか？ RIなら、どこかが汚染しているのかもしれません。 現像機が壊れていませんか？ 誰かがフィルムを明るいところであけませんでしたか？

サザンのメンブレンが黒くなる 削除/引用 No.1426-1 - 2008/06/25 (水) 18:16:43 - MIHO サザンについての質問です。 サザンのバンドの検出を確認できる場合とメンブレン全体（または上半分） が黒く(深紫色)なってしまうことがよくあるんです。 私だけでなく、同じ実験をしている人にも同じ現象がみられます。 同じバッファーで実験を行なった場合、黒くなる人とならない人が 出てくることもあるので、全く原因が分からなくて困っています。

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