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なるほど 削除/引用 No.1423-8 - 2008/06/26 (木) 10:59:45 - yamasaki なるほどdelta delta CT methodの時はすべての遺伝子の増幅効率を2/ 1 cycleとしているので、Ctが大きく違えばきもちわるいですよねえ。 いずれにせよ内因性コントロールについては頼りすぎてはいけないようですね。プライマーDBについては本当に便利なものに出会えました。ありがとうございました。

Re: 削除/引用 No.1423-7 - 2008/06/25 (水) 21:48:26 - UC 僕も、rRNAは他の遺伝子とコピー数が大きく違うということを言いたかった のですが、例えばComparative Delta CT methodでは、各プライマーでの増幅 効率がほぼ同じでないと使えません。テンプレート量が同じときに、例えば 18s rRNAでは、CT値が15で、一方見たい遺伝子のそれが30だった場合、ほんとに 正しく補正できるのか心許ないです。この手の実験は、preliminaryに、cDNAな どでの希釈系列を使って、増幅効率が同じかどうかを先ずチェックしますが、 18s rRNAであまり良い感触を得たことがないので。

(無題) 削除/引用 No.1423-6 - 2008/06/25 (水) 18:55:21 - う〜んと 先の投稿はrRNAと個々の遺伝子のmRNAではコピー数が大きく違うというつもりでしたが、 >ribosomal RNA/mRNAの比率が細胞種、組織種によってかなり異なる 具体的に証拠を示すことができませんが、印象としてこれは正しいと思っています。 生理条件によっても変動するのではないでしょうか。 最近のトレンドとしてはどうなってるのか調べたことがありませんが、論文としてはDNAマイクロアレイのメタ解析をした例がいくつかあるようです。 ひとつを紹介しておきます。 http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=1976390 細胞あたりのmRNAコピー数を考えたりして、じゃぁ細胞の大きさは？とか、翻訳装置の数は？などと、どんどん突き詰めて考えると絶対的に安心できるリファレンス遺伝子は無いということになって、自分的には対照実験が大事っていうことになっています。

ありがとうございます。 削除/引用 No.1423-5 - 2008/06/25 (水) 15:22:03 - yamasaki ご紹介頂きましたDBですが、非常に参考になりました。 少し疑問があるのです、質問させてください。 18s ribosomal RNAは発現差がありすぎる・・とのことですが、real-time PCRの時ハウスキーピング遺伝子の発現量で正規化することで、RT反応の時のRNA投入量とRT反応の効率の違いを無視できるようにしていますよね。突き詰めて考えると、この正規化という作業は結局RNAの全体量でやるということになるのではないでしょうか？そうするとtotal RNAの全体量で正規化するのであればribosomal RNAを使うのが一番良さそうですよね。でもmRNAの全体量で正規化するのであればmRNA量と一致して動くような遺伝子（厳密にはそんな遺伝子は存在しませんが）を使えば良いですね。 そうしますと、「18s ribosomal RNAは発現差がありすぎる」というのは、ribosomal RNA/mRNAの比率が細胞種、組織種によってかなり異なるのでmRNAの全体量の動きとは異なるので使いにくいという意味ととらえたら良いのでしょうか？ ただtotal RNAの全体量で正規化するのは細胞数で正規化するのに近いものがあると思われるので、mRNAの全体量で正規化するよりもむしろ良いことのようにも感じます。 このあたりあまり知識がなく、現在のトレンドを知りませんのでご教授頂けましたら幸いです。

Re: 削除/引用 No.1423-4 - 2008/06/25 (水) 15:01:54 - UC >個人的にはrRNAをリファレンスにするのは発現レベルが違いすぎるので >好きではないのですが、どうなんでしょう。 僕もそう思います。あまりに発現レベルが違うと、Comparetive Delta CT methodなんかは使いにくくなる気がします。しかも、この手のタンパクは pseudogeneや似た配列がふんだんにゲノム上に存在するので、specificな 増幅を示す配列を探すのは困難ですし。 以下も代表的なDBです。 http://web.ncifcrf.gov/rtp/gel/primerdb/ http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/ ヒトであれば、古典的ですがACTB, GAPDH, B2Mは、比較的いろんな系で 変動が少ない印象です。マウスならACTB, GAPDHはオススメしません。

(無題) 削除/引用 No.1423-3 - 2008/06/25 (水) 14:10:13 - う〜んと プライマーのデータベースが過去に紹介されてました。 http://medgen.ugent.be/rtprimerdb/ 検索すると他にも出てきます。 対象の生物種を書かれてませんが、ヒトやマウスのの18S rRNAは登録されてないかも？ 個人的にはrRNAをリファレンスにするのは発現レベルが違いすぎるので好きではないのですが、どうなんでしょう。

１８ＳリボソーマルRNAのプライマー 削除/引用 No.1423-1 - 2008/06/25 (水) 13:37:54 - yamasaki 過去レスにあると思いますが、キーワードの選択が悪いのか見つけられませんでしたので、新しいトピックとして質問します。 これまでTaqmanプローブでreal-time PCRをやってきたのですが、もったいないのでSybrGreenバッファーでやろうかと思っています。そこで内因性のコントロールとして18s ribosomal RNAのプローブを作成したいのですが、どなたかうまく動くプライマーペアをご存じでしたらご教授願えませんでしょうか？

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