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(無題) 削除/引用 No.1422-14 - 2008/06/27 (金) 17:07:37 - おお > また、おおさんと同様自分もアノードとカトードで違う > buffer組成でやってます。 > ゲル側にはSDSを入れてタンパクを流出しやすくする一方MeOHは入れないことで固定化させないようにして、逆にメンブレン側はSDS抜きでMeOHを加えることで吸着しやすくさせてます。非常に良好な結果が得られてます。 > この方法でうまくいくのではと考えていたのですが、やっている方がいたんですね。

(無題) 削除/引用 No.1422-13 - 2008/06/27 (金) 16:54:53 - おお > セミドライでアノードとカソードでバッファーの組成を変える、と見て > そんなこと可能なのかな、システムが根本的に違うのかと思いました。 > (セミドライだと、１種類のバッファーに浸す／を振りかけるイメージだったので) > 確かに上下でバッファーが違いますので、フィルターペーパーを浸すバッファーは必要最小限という点では気を使った方がいいですね。上下一緒のバッファーなら、たしょうまき散らしても全然気になりませんが。

(無題) 削除/引用 No.1422-12 - 2008/06/27 (金) 16:38:34 - L >おお様 ありがとうございます 形が違っていて、基本的には同じ構造のようですね。 セミドライでアノードとカソードでバッファーの組成を変える、と見て そんなこと可能なのかな、システムが根本的に違うのかと思いました。 (セミドライだと、１種類のバッファーに浸す／を振りかけるイメージだったので)

(無題) 削除/引用 No.1422-11 - 2008/06/27 (金) 15:00:52 - おお >[Re:10] Lさんは書きました : > >おお様 > お使いのシステムのメーカーはどこのものでしょうか？ > 教えていただきますでしょうか。 セミドライはバイオラッドのものを使っています。 http://kirschner.med.harvard.edu/files/protocols/BioRad_transblot.pdf 今使っているのは白金電極ですが、同じ(とおもう)バッファー組成で炭素電極のものを使っている人もいましたので、電極とかに気を使う必要はないかと思います(自信はありませんのでプロダクトマニュアルなどで確認してください、特に購入を考えている場合は購入前にご確認お願いします)。 あとバイオラッドのまえはowl(だったと思う)とかかれたやつを使ってました。これは電極が上したが逆で泡が立つ時の考慮とかされていないではとおもっていたのですが、使ったかんじでは問題がありませんでした。 最近インビトロジェンがトランスファーのシステム化したものを売り始めたようですが、わたしはシステムというよりは、プロッターかって、そこにゲルを乗っけているだけという感じです。ですから、日本へいどうやバイオクラフト、アットーなどどこのやつでも大丈夫ではないかと思います(使い勝手、好み、壊れやすいかどうか.....などはあるとは思いますが) バッファーそせいはミリポアのトランスファーの解説にあるやつを(電極によって使い分ける場合のバッファーですが)使ってます。 ただ、実際は先に0.75mmでpH9.5ぐらいのトリス-グリシンバッファーで条件を決めてしまっていますので大抵はそれでやってます。1.5mmで誰かがその条件でトランスファーしてうまく移らなかったと騒いでいたので、それじゃあという事でちょっと違うバッファーのやり方をかじってみただけです。

(無題) 削除/引用 No.1422-10 - 2008/06/27 (金) 12:42:31 - L >おお様 >セミドライはバッファーをアノードとカソードで違うバッファーがつかえます。 とありますが、お使いのシステムのメーカーはどこのものでしょうか？ 教えていただきますでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1422-9 - 2008/06/26 (木) 15:50:01 - 小児科医師（ゆとり教育） > 好みにもよるのですが定電圧はあまりお勧めしません。メーカーの説明書 >などにも15Vの定電圧で１５〜３０分程度と明記されてますが、実際に多くの >サンプルでやって慣れてくると、定電流のほうが明らかに再現性が高く安定 >した結果を得られます。 参考になる情報、ありがとうございます。私もメーカーの説明書に従って定電圧でやっていたのですが、次回は定電流でやってみます。助かりました。

(無題) 削除/引用 No.1422-8 - 2008/06/26 (木) 08:03:50 - 通りすがり >分子量の大きい（？）40-60ｋDの分子が >十分に転写されませんでした。そこで、transferの時間が短いのではと >思って、質問させていただいた次第です 経験的なものですが分子量が小さい (<30kDa) 分子の場合 trasnferは時間によりblottingの効率の変化は顕著ですが、 それより大きい分子量のタンパクなどでは bufferや電流などの条件を固定化して 時間の長さを変えても思ったほどの改善は得られないことのほうが多いです。 特に100kDaとかを超えると、セミドライの場合 いくら長くしてもほとんど効果はないです。 あとセミドライの場合、特に時間を長くするとbufferがdry outしてしまい 転写ムラが生じしてしまうことが多いため、お勧めしにくいです。 パラメーターとしてMeOH(5~20%), SDS(0~0.1%), Tris濃度(25~100mM) の範囲で変化させるのが一番転写効率には変化が起きます。 また、おおさんと同様自分もアノードとカトードで違う buffer組成でやってます。 ゲル側にはSDSを入れてタンパクを流出しやすくする一方MeOHは入れないことで固定化させないようにして、逆にメンブレン側はSDS抜きでMeOHを加えることで吸着しやすくさせてます。非常に良好な結果が得られてます。 >6cm×8cmのメンブレンを15V定電圧で20分、transferすれば十分 好みにもよるのですが定電圧はあまりお勧めしません。メーカーの説明書などにも15Vの定電圧で１５〜３０分程度と明記されてますが、実際に多くのサンプルでやって慣れてくると、定電流のほうが明らかに再現性が高く安定した結果を得られます。

(無題) 削除/引用 No.1422-7 - 2008/06/25 (水) 16:36:52 - おお あ、私の述べた条件はすべてセミドライです。

(無題) 削除/引用 No.1422-6 - 2008/06/25 (水) 16:35:04 - おお メンブレンの大きさはだいたい同じくらいですが、フィルターペーパーを10x10cmぐらいにしてやっています。で電圧は15V程度で、300mAの位の定電流で流しています(3mA/cm2という計算になりますか)。ただフィルターペーパーを置いていないところをシールしていませんのでその条件で電圧を見て、電圧が十分かかっていない時は電圧が15Vぐらいになるように電流を調整しています。 バッファーはpH9ぐらいのあまりポピュラーでない(と思っている)トリスバッファーです。今手元にレシピはありませんので必要であればあとで示します。時間は90minを超えるとバッファーが限界に達する直前の状態なので70-90minです。ゲルはグラジエントは使ってません。ゲルの濃度にもよりますが、上から1/3は残る傾向にあるので、一番見たいものが1/3以上移動するゲル濃度をなるべく選んでます。ゲルの厚さは0.75mmです。メタノールは20%を基準にしてますが100kDa以上であれば5%ぐらいまで下げることもあります。5%より低いとうまくトランスファーされません。ちなみにメンブレンはニトロセルロースです。トランスファーのバッファーにはSDSは入っていません。 セミドライはバッファーをアノードとカソードで違うバッファーがつかえます。マイナスにpH10位のトリスプラスにpH9.4ぐらいのバッファーを使うシステムがあったと思いますが、1.5mmのゲルを一度それでやった時は15Vでたしか200mAぐらいだったような気がします。トランスファーは良好といえばそうですが、CBBでうっすらと残っていて、同量をのサンプルを流してCBBの染色をしたのとの比較では95%ぐらいはトランスファーされているだろうと思えます。でもゲルに残るのがちょっと気持ち悪いです。機会があれば条件をもう少し改良しようかと思ってます。

(無題) 削除/引用 No.1422-5 - 2008/06/25 (水) 14:54:00 - 小児科医師（ゆとり教育） 言葉足らずで申し訳ありません。セミドライ式です。私もつんさんと 同じく、上司には6cm×8cmのメンブレンを15V定電圧で20分、transfer すれば十分だといわれましたが分子量の大きい（？）40-60ｋDの分子が 十分に転写されませんでした。そこで、transferの時間が短いのではと 思って、質問させていただいた次第です。ご回答、ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.1422-4 - 2008/06/25 (水) 14:22:40 - L >ウェット式なのかセミドライ式なのかでも異なるのでは？ そうでしょうね 私はセミドライでしかやったことがないので、セミドライの条件しかしらないんです

(無題) 削除/引用 No.1422-3 - 2008/06/25 (水) 14:05:35 - つん 前のラボでは、2mA/cm^2、CC、60-90 minでした。 今のラボでは、メンブレンサイズに限らず180mA、CC、30 min、5×trans buffer使用（10％メタノール）と指示されました。 しかし30 minでは分子量の大きいタンパクがしっかり転写されずにゲルに残ってしまうので私は60 minでやっています。 （いずれもセミドライ） ウェット式なのかセミドライ式なのかでも異なるのでは？

(無題) 削除/引用 No.1422-2 - 2008/06/25 (水) 13:24:47 - L メンブレンの大きさや種類(NCM, PVDF)に関わらず、 ATTOのパワーサプライを用いて 2 mA/cm^2, constant current, 90 min でやっています。 電圧は最初10V前後で最終的に40-50Vぐらいになるようです。 こういう転写の条件は、blotting bufferの組成も絡んでくると思うのですが、どうなんでしょうか

Western blotのtransferに使う電流・電圧 削除/引用 No.1422-1 - 2008/06/25 (水) 13:00:13 - 小児科医師（ゆとり教育） みなさん、Western blotのtransferの時に、どれくらいの電流・電圧を 使っていらっしゃるでしょうか。メンブレンの大きさ（XX cm × YY cm）、transferの時間、定電圧か定電流かも教えていただけると助かります。 私は、6cm×8cmのメンブレンを15V定電圧で20分、transferしています。 電流は、0.8mA/cm2くらい流れます。

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