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(無題) 削除/引用 No.1421-14 - 2008/06/26 (木) 21:03:36 - ImageH それとAPさんも言われてる各ピクセルが飽和してないことが一番重要です。ただこれはImageJではわかりにくくて（本当はヒストグラムをみるとわかります）、測定の時に、共焦点顕微鏡なら、各ピクセルが飽和してるかどうかを調べる方法が大抵ついています。要するに最大輝度に達しているピクセルがあるかどうかでみるわけですが。これは機種によって違うので、メーカーの人にきけばわかりますよ。

(無題) 削除/引用 No.1421-13 - 2008/06/26 (木) 20:55:51 - ImageH フォトンカウントという言葉は正確には、一つ一つの光子を数える測定のことを言います。ですから、普通の蛍光観察のことは指しません。蛍光相関分光法（FCS)やその親戚のPCH、これはまさにフォトンカウントヒストグラムの略語ですが、そういう動きを調べる方法のことをいいます。もちろん蛍光の強さはフォトンカウントの蓄積をみているわけで、全く違うわけではないですが。 蛍光の明るさは相対量なので、APさんの言われるようにどこかで定義するしかないです。relative fluorescent unitというのは、unitがちょっと、という気がするので（間違いではないです）、APさんの言われるようないい方や、単にrelative fluorescence (arbitrary unit)といういい方をよくします。

(無題) 削除/引用 No.1421-12 - 2008/06/26 (木) 12:49:07 - AP >蛍光強度RFU（relative fluorescent unit）とは言わないのでしょうか。 legendやmethodに測定方法と定義を書いておけばそれでも良いのかもしれませんが。 画像の輝度のことをいうなら、Relative intensity of brightnessとかIntensity of brightness (arbitrary unit) かなあ。 そういうとき、みなさんはどうしているのでしょうかね。

(無題) 削除/引用 No.1421-10 - 2008/06/26 (木) 12:10:13 - oshima APさん、ありがとうございます。 フォトンカウントではなく、 画像からデンシトメトリーを使って求めた場合、 蛍光強度RFU（relative fluorescent unit）とは言わないのでしょうか。 ただのrelative　Ratio？ですか？

(無題) 削除/引用 No.1421-9 - 2008/06/26 (木) 11:33:28 - AP >この場合、フォトンカウントでは無いということですが、これでも大丈夫なのでしょうか 一般的なデンシドメトリー（電気泳動のバンドの濃さや輝度を測るような）程度の信頼性、有用性あります。こういう測定をやったら測定値に二倍の差があったとかいうのは事実として正しいですが、それをもって蛍光量も二倍だとか、標的タンパク質が二倍だとは言えません（言われるまでもないことと思いますが）。 フォトンカウントは、原理的に無限大のlatitudeがありますが、デジタイズした画像はlatitudeが限られていて、撮像した画像に飽和したり暗くてつぶれたところがあると、latitudeからはみ出して差が出なくなります。階調も1ピクセルあたり256段階とか約65000段階とか（画像ファイルビット数、ソフトウェアの仕様による）表現力に制限があります。 また、不用意に画像に手を加えると（コントラスト、明度など）、測定値に影響が出る場合があります。

(無題) 削除/引用 No.1421-8 - 2008/06/26 (木) 10:56:56 - oshima 大変わかりやすい解説をありがとうございます。 さっそく 画面の細胞をくくる面積とその細胞の数を全部揃えて 比較してみたいと思います。 この場合、フォトンカウントでは無いということですが、これでも大丈夫なのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1421-7 - 2008/06/25 (水) 21:16:15 - ImageH 意外とわかりにくいですよね。もし1枚の画像の中で、たとえばある細胞の明るさと別の細胞の明るさを比較されてるのであればImageJでは簡単で、細胞の輪郭をpolygon（下の左から3つめのtoolで）かfreehandかで囲って、Ｍeasureを押せば、Resultsの中に、areaとmeanが出ます。この項目はMeasureの下の方にあるSet Measurementsでいろんなのが選べます。他の細胞を測定するには、これを横にずらして、Measure（面倒なのでCtrl M)を押すと、次の値が出ます。あるいは、毎回違う形を描いてMeasureしてもいいです（面倒ですが）。相対量は、meanとareaをかけたものになります。バックは、何もないところを測ればいいです。 もし別の画像の中でのたとえば細胞の明るさを測るには、一番簡単なのは、同じ大きさの円か、四角を選んで、Measureすることです。これをpolygonでやるのは難しいです。サイズは下に出てますからそれでmanualにやるしかないと思いますが、他の手をごぞんじしたらどなたか教えてください。

(無題) 削除/引用 No.1421-6 - 2008/06/25 (水) 19:34:27 - AP >さっそくimagejでTIFFファイルを開き、ツールバーからヒストグラムを選んだところ、meanという値がでましたが、これをただ比較するだけで良いのでしょうか、、？？ どういう測定をしたいかによって、どの機能を使うか、測定範囲をどう設定するか、オフセットをどうとるか、非常に多くのやり方があるでしょう。 いろいろいじりながら、マニュアルを読みながら、ベストのやり方を見つけてください。 もうすこし、具体的に何を測定しようとしているのか情報があると、 使い込んでいるユーザがら具体的なアドバイスがあるかもしれません（わたしはあんまり難しい使い方をしていないので、お役に立てないと思います）。

(無題) 削除/引用 No.1421-5 - 2008/06/25 (水) 19:25:21 - AP 画像にしてしまうとフォトンカウントはできません。

(無題) 削除/引用 No.1421-4 - 2008/06/25 (水) 19:21:42 - qq 共焦点はカメラ画像ではなく、フォトンカウントでしょう。

(無題) 削除/引用 No.1421-3 - 2008/06/25 (水) 17:32:36 - oshima 早々のお返事ありがとうございます。 さっそくimagejでTIFFファイルを開き、ツールバーからヒストグラムを選んだところ、meanという値がでましたが、これをただ比較するだけで良いのでしょうか、、？？

(無題) 削除/引用 No.1421-2 - 2008/06/25 (水) 12:55:57 - AP 共焦点のシステムにそういう機能がついているかもしれません。 フリーソフトならNIHのImage Jはどうでしょうか。 http://rsb.info.nih.gov/ij/ どっちにしろフォトンカウントではなく、カメラ画像で測定すると言うことは、 フィルムの黒化度をデンシドメトリーするレベルになりますが。

顕微鏡画像から相対的な蛍光強度を比較したい 削除/引用 No.1421-1 - 2008/06/25 (水) 11:57:52 - oshima 共焦点顕微鏡で得た画像から相対的な蛍光強度RFU（relative fluorescent unit）を求める方法をどなたかご存知ではないでしょうか。 そういうソフトウェアがあるならば教えてください。 プレートリーダーや光度計は都合上使えなくて困っています、、

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