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(無題) 削除/引用 No.1420-13 - 2008/07/04 (金) 11:31:57 - AP >ラベルされたプローブとされていないものとはやはりされていないプローブのほうがハイブリダイゼーションしやすいのでしょうか。 どちらも同じと考えていいのですが（厳密に言うとRIラベルでなく化学修飾のラベルの場合はTmに若干の影響があるでしょうけれど）、投入した鋳型に対して出来たプローブ量が少なければ問題です。 例えば入れた鋳型が3 ugに対して、出来たプローブが300 ngしかなかったとしましょう（これは実際起こりうる値ですが）。非標識DNAと標識DNAの比が10:1だとしたら、ターゲットにハイブリするDNAも非標識と標識の比が10:1になると考えられます。ゲノムサザンではpgオーダーのターゲットを検出するのが普通ですが、ハイブリしたDNAのうち標識されたものが1/10しかなければ、検出は困難です。 その他にも、ゲノム中にターゲットがpgオーダーであるのに対し、ハイブリに10 ngプローブを使ったとして、一緒に持ち込まれる鋳型が100 ngもあるとなれば、ターゲットよりも鋳型に対してハイブリするプローブの方が多くなってしまいます。 先の書き込みで忘れていましたが、プローブのラベル効率をあげるパラメータとして、ラベル反応時間を長くするというのもあります。一時間反応よりO/N反応の方が効率があがります。とくに鋳型量を多くするときはO/Nすべきですね（ugオーダーの鋳型の場合、合成されるプローブ量との比率は、O/N反応してようやく1:1くらいになる）。そのへんの情報も含め、RocheのDIG filter hybridizationのハンドブックを見てください。

(無題) 削除/引用 No.1420-12 - 2008/07/04 (金) 10:41:26 - 蒼い 来週からプローブを作り直して、サザンを再開しようと思います！ たくさんのアドバイス、本当にありがとうございました。 APさん、 濃くしようかなと思っていました。 危なかったです！ ラベルされたプローブとされていないものとはやはりされていないプローブのほうがハイブリダイゼーションしやすいのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1420-11 - 2008/06/27 (金) 10:36:48 - AP 念のため付け加えますが、 >検討してみたところ、プローブの濃度が低すぎたと思われます。 もし、前記のような方法でプローブをチェックしてみて比活性（鋳型量に対する合成されたプローブの量）が低い場合は、ハイブリのときに同じプローブを濃度を濃くしても良くなりません（標識されたプローブとそれに競合する無標識の鋳型の割合は変わらないので）。 そういうときはプローブを作り直します。 HighPrimeの標準反応ではたしが最大3 ugの鋳型まで加えることが出来るとありますが、投入する鋳型DNAが多ければ多いほど、反応効率は下がって比活性が下がります。高比活性のプローブを作るときは鋳型DNAをなるべく少なく、例えば100 ngくらいにしましょう。それだけあれば、ハイブリ時のプローブ濃度を10 ng/mLとしても10 mLのハイブリバッファに相当するので十分でしょう（DIGプローブ入りのハイブリバッファは繰り返して使えますし）。 私は、Northernなど高感度が要求される場合には、鋳型量をうんと減らして20 ngくらいにしてやることもありますし、逆に感度はそれほど要求されないけれど大量のハイブリバッファが必要なプラークハイブリのようなときは、規定量ぎりぎりに鋳型をふやしてやります。 ほかに、ラベル効率に影響を与えるファクターは、鋳型の精製度（よっぽど汚くなければあまり問題になることはない）、反応前の鋳型のdenature（沸騰水に浮かべて十分時間をかける。急冷は氷水より、ドライアイスエタノールやフリーザで冷やしたアルコールなどでやった方がいい）があります。

(無題) 削除/引用 No.1420-10 - 2008/06/27 (金) 07:04:38 - 蒼い APさん ニトロセルロース膜ではなく、ナイロン膜を使っていました。。。 すみません

(無題) 削除/引用 No.1420-9 - 2008/06/27 (金) 06:57:52 - 蒼い なるほど！ アドバイスありがとうございます！ 検討してみたところ、プローブの濃度が低すぎたと思われます。改めてハイブリダイゼーションを行ってみます。 その結果次第、また記入させて頂きます。

(無題) 削除/引用 No.1420-8 - 2008/06/25 (水) 17:09:10 - AP >膜の縁のところに黒くなっているのが気になります。 メンブレンの切り口の荒れが非特異的吸着を起こしやすく、ノイズの原因になることがあります。縁なら写真をトリミングすればいいですが、ノイズが見たいところに近すぎたり、発光（発色）が強すぎてかぶったりすると見苦しいので、避けるにこしたことはないです。 メンブレンは鋭利な刃物ですぱっと切ること、 それとゲルよりも一回り大きいメンブレンを使うこと。 古典的は上方へのブロットでは、ゲルサイズぴったりかやや小さめのメンブレンを使わねばなりませんが、縁が近すぎてノイズがじゃまになりやすいです。近年、広まっている下方へのブロット（downward blotting）は、効率の良さ、ゆがみにくさの利点の他に、メンブレンを大きめにできるので（そのほうが作業もしやすいです）、ノイズから距離を取ることができます。

(無題) 削除/引用 No.1420-7 - 2008/06/25 (水) 13:36:14 - AP >ラベリングの効率を確認したところ４−５ng/μlでした。 これだけでは評価のしようがないのです。 HighPrime (random prime labelling）でラベルしたプローブでしたら、投入した鋳型DNA量で換算して、どれくらい少量まで検出できるかを見てください。 入れた鋳型量に対して合成されたプローブが少ないと、比活性が下がります（ラベルの入っていない鋳型DNA自体もターゲットやプローブにハイブリするので、プローブと競合するため）。理想的には入れた鋳型量にたいして100 %（あるいはそれ以上）のプローブが出来るはずですが、効率が低い場合には感度不足の問題が生じます（RIでも同じですが）。 例えば200 ngの鋳型を20 uLの反応系でラベルしたなら10 ng/uL。 これを1 uLとって500 pg/uLから1 pg/uLくらいの範囲で段階希釈し、 それぞれを1 uLずつメンブレンにブロットして抗体で検出します。 鋳型DNA換算で数pgまで見えればまず及第。数十pgが限界なら、 高感度が求められるアプリケーションに使うのはやめたほうがいい、それより悪いなら論外という風に判断しています。 詳しいやり方は、説明書等を読んでください。比色コントロール用のラベル済みDNAが付属されているはずですし、専用のストリップも販売されています。

(無題) 削除/引用 No.1420-5 - 2008/06/25 (水) 12:08:44 - zazan 生物種は何ですか？哺乳類？

(無題) 削除/引用 No.1420-4 - 2008/06/25 (水) 11:53:30 - おお テンプレートを100pgほど流してポジコンにすると何が悪いか見えてくるかもしれません。ゲノムサザンを考えているのだとすると100pgでも多い方です。 電気えいどうが悪いのか、トランスファーが悪いのか、ハイブリがわるいのか、洗いが悪いのかなどチェックポイントは多岐に渡ります。ここでも何度も話題に上がってますので検索してみるのもいいかもしれません。 たとえば http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech2/biotechforum.cgi?mode=view;Code=1338

(無題) 削除/引用 No.1420-3 - 2008/06/25 (水) 11:10:03 - AP 発色と書いているから、化学発光ではないのかな。

(無題) 削除/引用 No.1420-2 - 2008/06/25 (水) 11:08:59 - AP まず一つ確認。 >ニトロセルロース膜に転写し、UV linkerで固定を行いました。 本当にニトロセルロースですか？ ニトロセルロースはUV固定できません（ヘタすると発火します）。 CDP-Starなどの化学発光はニトロセルロース上では強度が著しく落ちるので使えません（どうしてもやるときは、それように販売されている添加剤（ブロック剤）が必要です）。

一人で初サザンを行ってみましたが 削除/引用 No.1420-1 - 2008/06/25 (水) 10:59:47 - 蒼い 発色後、バンドが全く見えませんでした。 ラベリングはDIG-High Primerを使用して、テンプレートは約1.4kbのPCR産物（精製しました） ラベリングの効率を確認したところ４−５ng/μlでした。 制限酵素で消化したゲノムDNAを泳動し、ニトロセルロース膜に転写し、UV linkerで固定を行いました。ハイブリダイゼーションは約１７時間でした。その後、ストリンジェシー洗浄と免疫検出をマニュアル通り行いました。 全くバンドが見えませんでしたが、膜の縁のところに黒くなっているのが気になります。 ハイブリダイゼーションの温度やプローブの濃度を再検討して、やり直す予定ですが、その他に大事なポイント等ありますか？

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