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(無題) 削除/引用 No.1418-7 - 2008/06/25 (水) 09:38:50 - おお >[Re:5] ろぜさんは書きました : > みなさん早速のご回答ありがとうございます。 > > 以前この掲示板で検索したところ、ホモジェナイズ（ポッター型）でもDNAはずたずたになるとあったので、切れていると思い込んでいました。たしかにポリトロンでやったときはゼリーが少なかった気もします。。 ポリトロンはそこそこDNAを切ってくれるようで、ねんちょうでない溶液がえられますね。あとよく使うのは強めのソニケーターでしょうか。 > あと多糖類でゼリー状になるともあったのでひょっとしてスクロースが一因に？とも思ったのですが、これだったら絶望的でした。 スクロースは多糖でないので大丈夫だと思います。 > > ホモジェナイズ後に超音波をかけたあと（SDSまえ）でもbindingできる状態のタンパク状態は保っているでしょうか？なるべく、ぎりぎりまで同じ条件でサンプルづくりしたいです。 これはある意味運ですね。デタージェントを使ってないマイルドな条件を使って(多分そうだと思って)ますのでたんぱく質はネイティブな状態に近いと思います。問題は抽出できているかどうかです。それと超音波処理は酸化を伴うことがよくあります、バッファーにDTTか2ME入れてましたっけ。差し支えないのであれば入れた方がいいと思います。 ぎりぎりまで条件を同じと書かれてますが、得られたSDSフリーのタンパク(遠心した上清)にSDSを加えれば、同じソースで実験できますけど、、、、この方法だと遠心で核は多分沈降しますので、SDSでねばねばになることはないと思います。 > それとも、遠心後のゼリーを回収して超音波or針でピストンのがよいでしょうか？ピペットでゼリーを回収するのが困難だったので・・沈澱と分離するのが難しそうだなぁ、と。これはやったことありませんが、超音波後にまた遠心するべきでしょうか？ ネバネバした状態では遠心しても効果的に思えないのでSDSを加えて、超音波なり注射針などでなるべくさらさらにしてから遠心した方がいいと思います。 > あと、DNase処理で解決した事例はありますか？ 粗核フラクションを取ってきて、DNaseI処理して高塩濃度でタンパクを溶出したことはあります。DNaseIをしないと高塩濃度でDNAが溶出してネバネバになります。ただ個人的にDNaseIはタンパク溶出を迅速にやりたいので私はなるべく避けてます。SDSが入っているとDNaseIはちょっと厳しいのではないかと個人的には思ってます。

(無題) 削除/引用 No.1418-6 - 2008/06/24 (火) 21:38:07 - ろぜ >Aさん こちら作成中で、見られませんでした。 ひとつ選択肢がふえました。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.1418-5 - 2008/06/24 (火) 21:36:15 - ろぜ みなさん早速のご回答ありがとうございます。 以前この掲示板で検索したところ、ホモジェナイズ（ポッター型）でもDNAはずたずたになるとあったので、切れていると思い込んでいました。たしかにポリトロンでやったときはゼリーが少なかった気もします。。 あと多糖類でゼリー状になるともあったのでひょっとしてスクロースが一因に？とも思ったのですが、これだったら絶望的でした。 超音波ためしてみます。最初に書けばよかったのですが別実験とはbindingです。ホモジェナイズ後に超音波をかけたあと（SDSまえ）でもbindingできる状態のタンパク状態は保っているでしょうか？なるべく、ぎりぎりまで同じ条件でサンプルづくりしたいです。 それとも、遠心後のゼリーを回収して超音波or針でピストンのがよいでしょうか？ピペットでゼリーを回収するのが困難だったので・・沈澱と分離するのが難しそうだなぁ、と。これはやったことありませんが、超音波後にまた遠心するべきでしょうか？ あと、DNase処理で解決した事例はありますか？ 便乗グイグイ質問してすみませんが、お考えをきかせてください。 あと、最終的に核と細胞質を分離したいのにSDSをぶち込むのは考えなさすぎでした。反省です。 > 注意：卑猥な表現を含む） 歓迎です、どんどんお願いします。 申し訳ありませんがひきつづきよろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.1418-4 - 2008/06/24 (火) 21:19:45 - A DNaseIを混ぜて氷上で30-60分かけて分解するという手もあります。

(無題) 削除/引用 No.1418-3 - 2008/06/24 (火) 21:03:36 - それは DNAでしょう。SDSは核膜を崩壊させますから。 超音波処理か、もしくは1mlのシリンジに21Gの針を付けて腰を動かすようにピストン運動させてください。 ヌルヌルのDNAが「萎え」ます。（注意：卑猥な表現を含む）

(無題) 削除/引用 No.1418-2 - 2008/06/24 (火) 20:52:09 - ドナドナ ゲル化したDNAでしょうね。超音波処理をお勧めします。

SDS-PAGE用サンプルでゼリー状物質 削除/引用 No.1418-1 - 2008/06/24 (火) 20:07:08 - ろぜ ラット腎臓からSDS-PAGE用サンプルを作っています。 腎臓をbufferでかん流 ↓ ホモジェナイズ ↓ SDS(f.0.5%)を加えて氷上20分静置 ↓ 遠心　12100g, 4℃, 20分 ↓ 上清回収、4×leammli buffer としてるのですが、遠心後の上清がゼリー状になってしまいます。 buffer(50mM Tris, 6mM MgCl2, 10% sucrose)の基本組成はあまり変更したくありません。 遠心前後のタンパク濃度は8−15mg/ml程度です。 このゼリー状物質の正体はなんでしょうか？ そして改善点はどこでしょうか？ 目的タンパクを過剰発現させた細胞でも、同様なことがおこりました。 界面活性剤をSDSから別のものにかえる、氷上静置を室温にする、スケールを変える、超音波をかけてみる、など、手軽に改善できるのなら試してみたいのですが ・最終的には核、細胞質、ホールセルでの比較をしたい→bufferを変えずに超遠心でおとす、というのは避けたい ・あまりサンプルが入手できず、プロトコールをすこしずつ変えて検討できない ・SDS投入前のサンプルは他実験に用いたい（このためbufferの組成はあまり変更したくない） などの事情もあります。 これだと思う知恵がありましたらお教えください。

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