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Re 削除/引用 No.1411-6 - 2008/07/17 (木) 22:28:56 - x EDTAはDNaseIの活性を阻害しするので、トリプシンでばらす時は、EDTA抜きにします。

(無題) 削除/引用 No.1411-5 - 2008/06/27 (金) 12:49:19 - よっしー 細胞がほぐれているのであれば，9でDNaseをさらに100μL程度加えて， 少し振盪すればさらさらになると思います． そのあと遠心で細胞回収すれば大丈夫だと思います． ネバっとなるのは酵素を変えても同じだと思います． そこまでの処理をすばやくすれば多少ましにはなるのではないでしょうか． 私は，ミンスせずにブルーチップでピペッティングして，組織を細かくしてました． その方が時間短縮になりますから． グルコースは細胞の生存率を上げるために加えています． 酵素とは関係ないと思うのですが・・・．

(無題) 削除/引用 No.1411-4 - 2008/06/26 (木) 20:50:01 - washi 詳細なプロトコールを記載していただき, ありがとうございます. 現在私もよっしーさんが書かれたプロトコールを使ってラットのアストロサイトを分離・培養しようと試みているのですが, 酵素反応がうまくいきません. ニューロンは死んでも大丈夫です. 加えて質問なのですが, 細胞を分離する時のGlucose濃度は関係あるのですか？ 現在は0.1%Glucose含有HBSS中にTrypsin+EDTAが入っているのですが, 酵素反応と関係あるのかと… 基本的なこともわかっておらず, 勉強不足かもしれませんが御教授よろしくお願いします.

(無題) 削除/引用 No.1411-3 - 2008/06/24 (火) 20:24:47 - ろぜ この実験ではニューロンは死んでいいのですよね？ 以前マウス新生児アストロサイトを培養していた時のプロトコールですが 生後24時間以内のマウス新生児から脳を摘出→DMEM(FCSぬき)中で待機 ↓髄膜を除去 ↓脳をメッシュ (300 μm) で透過（ゴムへらでつぶしながら） ↓0.25% trypsin, 2000 Kunitz units Deoxyribonuclease 1 含有 DMEM(FCSぬき) でインキュベート　（37℃に温めたDMEM中で20分程度、時々攪拌しながら） ↓4℃, 2000 rpm, 10 min で遠心　× 2(FCSぬき) ↓メッシュ (53 μm) で透過 ↓細胞を回収 ↓10% FCS を含む DMEM 培地中で10日間一次培養 (37℃, 5% CO2, 95% air) ↓37℃, 120 rpm, 12~18 hしんとう（FCSぬき） ↓ ↓1 mM EGTA 含有 PBS で細胞を懸濁 ↓10% FCS を含む DMEM 培地中で5〜7日二次培養 FCSは非動化ずみ、一次培養はその後の振とうができるようにキャップボトル（二日に一回メディウムチェンジ）、二次培養でディッシュにまく 割と簡便な方法だと思います。 コンタミは、マウス脳摘出からの扱いが雑だと、普通の培養細胞よりは起きますが、丁寧にやれば防げます。

(無題) 削除/引用 No.1411-2 - 2008/06/24 (火) 10:02:19 - よっしー 私の以前やっていたマウスのプロトコールです． 参考になればよいのですが・・・． 1. 胎生14-18日齢のマウス胎仔を摘出しPBSに浸す． ここから6までは実体顕微鏡下で行う． 2. 頭皮を剥離し，先曲がりピンセットの先端で，頭蓋骨の矢状縫合に沿って割れ目を入れ，頭蓋骨を左右に開く． 3. 脳を下からつかみ摘出し新しいPBSに浸す． 4. 3-4匹の胎児について2-3の操作を行う． 5. ピンセットでつかむようにして，嗅球をつけたまま間脳，中脳を大脳半球から外す． 6. 大脳から嗅球を外しながら髄膜できる限り除去する．(髄膜の血管を目印に，髄膜の端をつかんで1度に取り去る) 7. 大脳半球を新しいPBSに移し，2本のメスでミンスし，15mLチューブに移す．(ここまでを出来れば30分以内に行う) 8. 2.5%トリプシン，5%グルコース含有PBSを1mL，1%DNase I水溶液を100μL加え，全量をPBSで10mLとし，37℃，250rpmで20分間回転振盪する． 9. Horse Serum(HS) またはFCSを5mL加え，800rpmで3分間遠心し上清を捨て，10%FCS含有DMEM/F12を1mL加える．(この時まだ細胞懸濁液に粘性があれば，1%DNase I水溶液を少し加える) 10. 数回ピペッティングし大きな塊がなくなれば，10%FCS含有DMEM/F12を10mL加える． 11. 静置し大きな細胞塊を静めた後，上清を回収する． 12. 遠心で細胞を回収し，10%FCS含有DMEM/F12を用いて，poly-L-Lysineコートしたディッシュに，2x107cells/10cmdishで播種する．

アストロサイト培養 削除/引用 No.1411-1 - 2008/06/23 (月) 21:07:32 - washi 現在, 神経細胞とアストロサイトの共培養を行うため, アストロサイト培養法の検討を行っています. 0.25% Trypsin-EDTA+0.01% DNaseで37℃, 20分酵素反応させて細胞を分離しようと試みているのですが, DNA(？)が絡み付き均一な溶液になりません. DNaseを足したりしてみたのですが, 何も改善されず, 何か良い方法はありませんか？TrypsinをPapainに変えてみても良いものなのでしょうか？

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