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(無題) 削除/引用 No.141-24 - 2007/10/22 (月) 20:01:36 - agar 気がつくのが遅くなりすみません。 レスありがとうございました。 ご指摘いただきました、 ＞バンドがスメア状 とありますが、バンドはスメアとなるわけではないようで、ブロードです。 ＞ゲルがくびれる　というのはカセットから外したときでしょうか？ はい。その通りです。流す前は問題がないのですが、流していると徐々にくびれてきます。

(無題) 削除/引用 No.141-23 - 2007/10/18 (木) 11:56:29 - ごそまる 初心者ですが似たような現象を僕も起こしたことがあります。 バンドがスメア状になってしまうときは僕の場合、 １）PCRがうまくいってない ２）ゲルにアプライする時にウェルからあふれさせた の2通りでした。 PCRがうまくないときは目的以外のPCR産物ができているということです。ランダムプライミングていうんでしたでしょうか。ホットスタートの酵素でもサーマルサイクラーが先客で埋まってて待たされたときなどではうまくいきませんでした。あるいはサイクル数が35(これは経験上の数字で根拠はありません)を超えるとやはり目的以外のバンドが出たりブロードになったりしました。 ウェルからこぼしたときはバンドらしいバンドは全く出ず、全体的にのっぺりした色(EtBr染色)になりました。特に量が少ないPCR産物をアプライする時はピペットで吹き出してしまったりしてこうなりました。 ゲルがくびれる　というのはカセットから外したときでしょうか？ 僕も電気泳動のあと、カセットから染色槽に移すとゲルのカセットと接触していた両辺がぬれた紙のように波打っていることはありました。 カセットに入れるゲルの量を少し少なくしたらなりにくくなりました。

(無題) 削除/引用 No.141-22 - 2007/09/06 (木) 15:19:58 - agar 有り難うございます。 >(1)常温で試薬を混ぜたときになりやすい。PCR直前までon iceで冷やしておくとなりずらい。 Hot Startで行っています。 >(2)酵素やMgを入れ過ぎるとなりやすい。 酵素は半分以下の量しか入れていません。 >(3)極微量の鋳型で、サイクル数(40-45など）が多いときになりやすい。 鋳型量は少なくはないです。サイクル数は25〜40まで >(4)PCR後室温で放置する時間が長いとなりやすい。 終わった後速やかに電気泳動しています。結果が早く見たいので（笑）。

(無題) 削除/引用 No.141-21 - 2007/09/06 (木) 14:58:11 - ats Taq系の酵素を用いたときスメア−になるときがあって、原因を探ったときがあります。 問題の起きないprimerと鋳型の組み合わせも多いのです。 (1)常温で試薬を混ぜたときになりやすい。PCR直前までon iceで冷やしておくとなりずらい。 Hot Startでも解決する。 (2)酵素やMgを入れ過ぎるとなりやすい。 (3)極微量の鋳型で、サイクル数(40-45など）が多いときになりやすい。 (4)PCR後室温で放置する時間が長いとなりやすい。 再現性は(1)＆(2)>(3)>>(4)です。Taq系酵素が有するTdT活性と関係があるのかな。

(無題) 削除/引用 No.141-20 - 2007/09/06 (木) 09:55:37 - agar 有り難うございます。 >ローディングダイも大丈夫ですか？ 市販の物、自ら調製したものなど、同じ現象が見られます。 >マーカーもサンプル同様にバンドが変になりますか？ なるときと、マーカーは問題がない時とあります。 >GelかBuffer、泳動槽に問題がありそうですが。 ゲルやバッファーは、研究室で同一の物ですが、問題が 一切見られない人もいます。 >周りの研究室で試薬・装置が借りれるのであれば、 それを使ってみてはどうでしょうか。 そうですね〜。たまたまそういう事（他研究室のgoodsを使用した） があったのですが、同じ現象が出ます。 色々、有り難うございます。

(無題) 削除/引用 No.141-19 - 2007/09/06 (木) 09:48:33 - げるぐ あまり関係がないかも知れませんがローディングダイも大丈夫ですか？ また、マーカーもサンプル同様にバンドが変になりますか？ そうであるとやっぱりGelかBuffer、泳動槽に問題がありそうですが。 もし、周りの研究室で試薬・装置が借りれるのであれば、 それを使ってみてはどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.141-18 - 2007/09/05 (水) 22:28:06 - agar ご回答ありがとうございます。 まず、 ＞ちなみに0.5xで作ったゲルを1xバッファーで泳動した という事はありません。同じ時期に二つの濃度のバッファーは調製しないからです。 また、蒸発した分の水分を添加して補っているかという点ですが、 基本的にしていません。 それほど、蒸発による水分量が多いと思っていなかったからです。 目分量では、さほどかわっていないかな？という確認程度ですので。 一度、実践してみます。

(無題) 削除/引用 No.141-17 - 2007/09/05 (水) 15:28:06 - そば ゲル中のバッファー濃度の異常の確認方法は無いですね・・・。 同じ時期に作ったゲルがあるなら、再溶解してTAEを加えて流し直してみると分かりますが・・・。 ちなみに0.5xで作ったゲルを1xバッファーで泳動したという覚えは無いですか？ それをやると、ゲルがくびれるというか、部分的に溶けたり薄くなったりすると思うのですが。

(無題) 削除/引用 No.141-16 - 2007/09/05 (水) 14:08:07 - ゲルル アガロースの熔解の際に、バッファーの水分が蒸発して泳動バッファーとの間に濃度差があるということはありませんか。私はいつも加熱前に容器ごと重量を量っておいて、溶解後に減少分のミリＱ水を加えています。

(無題) 削除/引用 No.141-15 - 2007/09/05 (水) 12:48:08 - agar ゲル中のバッファー濃度の異常は、どのようにしたら確認できるのでしょうか？ ゲルを作る際、1×もしくは、0.5×の大量に作成されたバッファーを 使用するので、TAEを入れ忘れる事は無いのですが、、、、 色々有り難うございます。

(無題) 削除/引用 No.141-14 - 2007/09/05 (水) 11:40:11 - そば TAEを入れずにゲルを作った時の現象に似ているような気がします・・・。 ゲル中のバッファー濃度に異常は無いですか？ ゲル作成の際に1xTAEを入れ忘れるとか、濃度を間違えるといったミスなど。

(無題) 削除/引用 No.141-13 - 2007/09/05 (水) 11:17:48 - agar サブマリンタイプで、バッファーにゲルは完全に浸っています。 また、バッファーはタンクで大量に作っており、 その都度、バッファーは新しい物に交換します。 よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.141-12 - 2007/09/05 (水) 11:12:42 - ゲルル 泳動時にはアガロースゲルは完全にバッファーで覆われるタイプの泳動槽（サブマリン式）ですか？泳動バッファーは同じものを何度も使いまわしていますか？ 泳動バッファーを何度も使いまわすと、電極近くのpHが変わってそのせいでゲルが縮むことがあります。

(無題) 削除/引用 No.141-11 - 2007/09/05 (水) 11:00:34 - agar 沢山の人にご回答くださり、有り難うございます。 まず、くびれるのは、電気泳動中です。流す前は、 どこにもくびれはありません。 くびれる箇所ですが、中央が多いですが、定まっていません。 勿論電気泳動用のゲルを使用しています。 組成その他は、他の人と全く同じです。 電気泳動中のバッファーの温度は、大して熱くなっていません。 何か、他に条件を提示しなくてはいけないでしょうか？ よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.141-10 - 2007/09/05 (水) 10:13:01 - aa 最初の投稿のところで気になる点は、 >また、寒天が途中でくびれた様になる事もたまにあります。 アガロースと寒天（アガー）は別物で、電気泳動ゲルを作成するのであれば、agaroseでなくてはなりません。もしも寒天プレートなどを作るときに使うアガーで泳動ゲルを作成しているのでしたら、アガーの中の解離基のせいで激しく発熱してしまいます。 あげ足取りでしたら忘れてください。

(無題) 削除/引用 No.141-9 - 2007/09/05 (水) 09:53:35 - ななし aさん 慣れていてきちんとした実験をしている人だったらそうかもしれませんね。 熱々でもちゃんとバンドは確認できます。冷ましたら気持ちきれいな気がするという程度です。 ただ、極めて厚さの薄いゲルを作ってしまう人（注ぐ量の加減ができない）や、ゲルをちゃんと溶かしきれているか定かでない、見ても良くわからない人（多少は余熱で溶ける）にはある程度冷ますのが有効な手でした。 agarさんがどのくらい実験に慣れているかわからなかったので。 しかし、泳動中にゲルがちぎれそうになってるとは。 そんな現象は熱々でトレーに流した時にも、後輩が溶かしきらずに作ったゲルでも 起こったところを見たことありません。 さすがにそれは固め方では解決できないと思います。 くびれるってどこがくびれてるんですか？？

(無題) 削除/引用 No.141-8 - 2007/09/04 (火) 21:06:45 - a 私はアガロースを溶かした後、すぐにトレーに注いでいますが、バンドはシャープですよ。 アガロースがくびれた状態になるというのは泳動中ですか？ 泳動中のバファー温度は異常に熱くないですか？ もう一度全ての組成が間違っていないか確認して、それでも解決しないようなら(マーカーでもブロードになる)、指導の先生？か上司？に言って解決してもらった方が良いと思います（おそらくアガロースが良くないんでしょう）。

(無題) 削除/引用 No.141-7 - 2007/09/03 (月) 09:49:26 - agar 回答くださりありがとうございます。 ゲルをどの様に固めるのかが、かなり重要なのですね。 注意してみたいと思います。 ゲルが流しているうちに切れそうになるのは、皆さん の回答して頂いた感じでは寒天の濃度差が原因だった という事が結論みたいですので、固めるの一つにも注 意を払わないといけないと思いました。

(無題) 削除/引用 No.141-6 - 2007/09/02 (日) 23:31:56 - ななし あの、熱々のゲルを流すと表面だけ蒸発したり、上の空気が触れる部分だけ冷めて 中が熱々だったりなんだりで均一に固まらないと習いました。 細かい現象はわからないですけど、実際ちゃんと冷ましてから注いだ ゲルの泳動像の方がきれいです。 完全にゲルを溶かし、それをギリギリ素手でもてるくらいに冷ます って感じがちょうどよいかと思いますが。 素手で持てるっていうのは、ちゃんとゲルメーカに注げるくらいしっかり持つってことです。 これだと大体50度弱くらいなのかなと思います。 バンド識別できないほどじゃないけど、微妙にきたないみたいなので。 普段は私もあまり気にしてませんが、ご参考までに。

(無題) 削除/引用 No.141-5 - 2007/08/31 (金) 22:03:38 - AGAR すみません。色々教えて頂きありがとうございます。 ゲルの厚みは考慮してみたいと思います。 applkyする量ですが、PCR産物を流すだけですので、 過剰量流しているとは考えていませんでした。 バンドは、後ろと前に引かれている感じのときがあります。 ばっちりきれいなときもあります。 バンドは、上と下がずれている様な感じではありません。 ゲルは、暑いうちに均一に流し込んでいます。 同じように作っても、部分的にくびれてしまう事があり、 困ってしまいます。 色々ありがとうございました。

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