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(無題) 削除/引用 No.1408-6 - 2008/06/26 (木) 17:43:11 - 中年 Xterminatorはシグナルが強いのも良いですよね。EDTA/NaOAc/EtOH沈殿でいかにロスってたかがよくわかりました。 ただ、うちのシステムだとPCR用の0.2mlチューブでは十分に振とうできないので、チューブを移す必要があったのと、値段が高いのとで、今はLPAをキャリアにEtOH沈殿するのに逆戻りしました。 キャリアを入れるとEtOH沈殿の時、氷上でのインキュベーション無しにいきなり遠心できるし、収率も格段に改善したらしくピークの高さが高すぎる程でした。プライマーの近傍もきれいに読めます。

(無題) 削除/引用 No.1408-5 - 2008/06/26 (木) 14:43:05 - AP >この時に白く濁る事があります。 EDTAはエタノールに溶けにくいので析出して当たり前と思って良いでしょう。 EDTA/NaOAc/EtOH沈殿も推奨される方法の一つですが、これをプレミックスすると100 %析出します。やっぱり順番に加えていくしかないでしょう。 アルコール沈殿による、BigDye sequenceサンプルの精製方法としては、ABIから、過去、いろいろな方法が提案されてきましたが、なかなか再現性や精製度の良いオールマイティな方法がなく、最終的にはEDTA/EtOHがベスト、短い鎖のシグナルが失われて支障がある場合はEDTA/NaOAc/EtOHにするというので、落ち着いているようです。 カラムではEtOH沈殿よりきれいに、再現性よく精製できますが、コストの高さ、カラムの準備や液の移し替えの手間などから、多サンプルを扱うときは苦しいところがあります。 で、いまこれがベストじゃないかと思うのは、この春くらいからABIから売り出されたXterminatorです。 http://www.appliedbiosystems.co.jp/website/jp/product/modelpage.jsp?MODELCD=110717 粘土のサスペンジョンみたいのをサンプルに加えて、しばらく振盪して、遠心でその粘土みたいのを沈殿させて上澄みを使うだけです。沈殿はそのままサンプルに残したままシークエンサーにかけることができ、heat denatureはしなくていい（むしろしてはいけない）です。カラム並みにきれいに精製できます。コストの比較はしていないのですが、この楽さを一度経験したら、EtOH沈殿やカラムには戻れません。 まわしものみたいになってしまいました。

(無題) 削除/引用 No.1408-3 - 2008/06/26 (木) 12:04:49 - taka 酢酸ナトリウムとエタノールを使う方法はどうですか？ あと、最近は、セファデックスビーズとカラムを使用する方法に切り替えたのですが、サンプルが多いときには異常にラクですよ。

(無題) 削除/引用 No.1408-2 - 2008/06/23 (月) 11:19:42 - 中年 エタノールのせいでEDTAの溶解度が落ちて析出しているのだと思います。シークエンス反応液に加えれば適正な濃度になって再度溶解しますが、問題なのはその前段階で析出したEDTAが沈殿してしまうので、加えるEDTAの量が不均一になってしまうことです。手抜きをしないで別々に加えるか、別の方策を考えるべきだと思います。

Sequence用のエタ沈について 削除/引用 No.1408-1 - 2008/06/23 (月) 11:11:37 - みず はじめまして。理由がわからない事があるので、質問させて頂きます。 私のラボでは、BigDye v3.1を用いてsequence反応を行なっており、 PCR後のエタ沈時にEDTAとEtOHを加えます。 サンプルが大量な時は事前にEDTAとEtOHを混ぜるのですが、 この時に白く濁る事があります。 これはなぜなのでしょうか。また透明に戻すことはできないのでしょうか。 どうか教えてください。

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