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(無題) 削除/引用 No.1402-26 - 2008/06/24 (火) 13:00:24 - AP >「二倍体の細胞からでも十分に変異源処理すれば劣性ホモの変異株が取れる」 なるほど、LOFのホモ接合（というより相同遺伝子のdouble knockout、heteroallelec mutant）とねらうということですか。読み切れてませんでした。 EMS処理をする場合、死なない程度、あまりたくさんの遺伝子を同時にヒットしない程度のdoseという縛りがあるので、ゲノムサイズや生物種にもよりますが、おおざっぱにいって、1遺伝子座がヒットされる頻度は数万分の1というのが相場だと思います。相同遺伝子が同時にヒットされる確率はその二乗で数億分の一以上。確率は非常に低くなりますが、力業で大規模なmutagenesisをすれば出来ることでしょう。あとは、どれくらいスクリーニングしたら興味の突然変異がとれるか、見ている表現型にかかわる遺伝子座の数、それと当人の引きの強さにかかってきますね。 もちろんその過程で、ヘテロ接合で表現型の現れる突然変異も出てくるかもしれませんから、結局、やることは一緒ですね。

(無題) 削除/引用 No.1402-25 - 2008/06/24 (火) 12:59:34 - ~ >ＡＰさん >siRNAの案は確かに面白いと思うのですが個々のsiRNAの"効き具合"の影響が大きいように思います。それと価格の問題があるかと思いますがその点はいかがでしょうか？ 私がやったときは、 ヌルベクターを入れた細胞でも死なないのが出てきたり、取れたsiRNA配列のターゲットが何なのか分からなかったりと、散々でした。 ただ、それでも入れた配列は回収できるので、変異剤処理でタンパク質量が減ることを期待するよりかは効率がいいと思います。 研究費がふんだんにあるラボで、 大規模なスクリーニングでたくさんの効果のあるsiRNAを取ってきて、 それらのターゲット候補のなかで重複するものを見つけて、 それを調べるというやり方でないと取れないのかなと思いました。

(無題) 削除/引用 No.1402-24 - 2008/06/24 (火) 12:35:25 - 理学部４年 みなさん おはようございます！！ そして、この二日間頂いた情報をしっかり調べ、なんとなくですが、その実験系を考えられるようになったと思います。 ところが、今もう一度このトピックを訪れてみるとなんと、まだアドバイスが続いていました！！ めちゃくちゃ嬉しいです！！当の本人が不在ですみませんでした！！ 今日の５時カンファがあるので、それまでもう少し質問に答えられるようにしなければならないので、お礼はもう少し時間をください。必ず書きます。 今までは先輩について特に疑問にも思わず、手だけを動かしていました。 ですが、先輩が不在になった時、自分は何もわかってなかったんだなあ。って本当に実感しました。 ですが、biotechnical forumを教わって質問のトピをあげましたが、色々な実験法があるのだなあ。と思いました。しかしどの実験系にも弱点が存在することもここで学びました。 僕は４年ですが、みなさんは今大学院生の方々なのでしょうか？ 現在、就職と進学を迷っています。 ですが、みなさんから頂いたヒントを元に、自分でこの２日間ずっと調べたりスライド作ったりしていましたが、研究にとても興味がわきました。本当にみなさんありがとうございます！！ みなさんから頂いた新たな書き込みについてもまだ理解が足らないので、またいつか質問してしまうかもしれませんが、その時はどうぞ宜しくお願い致しますn(_ _)n 卒論のacknowledgeにはぜひここのことを載せさせていただきたいです！！ ありがとうございました！！！

(無題) 削除/引用 No.1402-23 - 2008/06/24 (火) 12:18:45 - アイリ ＡＰ様、 私の書き方がまだるっこしくて済みません。「二倍体の細胞からでも十分に変異源処理すれば劣性ホモの変異株が取れる」ということを言いたかったのです。これなら、単に毒素を掛けて生き残る細胞を取れば良いということですよね。もちろん、想定している毒素の受容体が生育に必至なタンパク質であれば、そのような変異株は単純なLOFとしては取れないので厄介になるということはあると思います。 また、変異株の単離が容易（？）であるのに対し、原因遺伝子を発現クローニングで同定するのはネガティブスクリーニングになるので現実的でないというのはありますね。 レトロウイルスをつかうジーントラップならば、劣性ホモの変異体を取るというのはさらにあり得ないことでしょう。ドミナントネガティブ変異、あるいはLTRによる高発現を期待することになるのでしょう。

(無題) 削除/引用 No.1402-22 - 2008/06/24 (火) 11:06:23 - あいうえお ジーントラップに興味がおありでしたら、 phoenix gene trap で、検索ください。いろいろな論文がひっかかってくると 思います。

(無題) 削除/引用 No.1402-21 - 2008/06/24 (火) 09:46:52 - Caspase あいうえおさんが提案された >この手をつかうくらいなら、ジーントラップをお勧めします。 >レトロウイルスをゲノムの任意の箇所に挿入させて、 >遺伝子機能をつぶす変異導入法です。 の系は良さそうですね。 耐性クローンのcDNAを導入する案はドミネガ的な変異が起こっていることを期待してのことなのですが、この方法だと発現低下によるものを見落としてしう点で弱く、シーントラップはその点が改善されますね。 ~さんの提案された、siRNAの案は確かに面白いと思うのですが個々のsiRNAの"効き具合"の影響が大きいように思います。それと価格の問題があるかと思いますがその点はいかがでしょうか？ いえ、最近siRNAライブラリーを用いた検討を始めようかというところでしたので少し便乗させていただきました。(笑)

(無題) 削除/引用 No.1402-20 - 2008/06/23 (月) 18:10:47 - AP ＞求める表現型がはっきりしたものであって、上手い濃縮を掛けることができるならば（薬剤耐性などはピッタリでは？）、 まったくその通りなのですが、そこが問題で、この場合、どうすれば可能か、どうも私にはぴんとこないのです。LOF変異のヘテロ接合で表現型のあらわれる遺伝子は、運良くhaploinsufficientであるか、そうでなければ遺伝子量の低下による中間的な表現型が判別できるという条件が必要だと思います。毒素によって野生型は死ぬ、生き残る変異体をとる、というシチュエーションでやるにはどういうストラテジーが可能か、何か具体的なアイデアはありますか。 毒素への感受性が下がって、全滅は免れて少しは生き残るとか、増殖が遅くなるけれど死にはしないとか、都合の良い中間的なcriteriaがあるといいですが。 もちろん、変異が毒素感受性に関してhaploinsufficientな遺伝子に当たっていて、毒素があっても普通に生存可能というのがとれないとも限らないですが。

(無題) 削除/引用 No.1402-19 - 2008/06/23 (月) 16:52:51 - アイリ 決して「簡単に」というつもりはありませんが、loss-of-functionの変異体を培養細胞から取った仕事は昔から沢山ありますよ。ご退職されましたが、九州大学にいらっしゃった西本先生のグループでは、細胞周期特異的に止まる温度感受性変異細胞を沢山取って原因遺伝子を決めておられましたし。求める表現型がはっきりしたものであって、上手い濃縮を掛けることができるならば（薬剤耐性などはピッタリでは？）、二倍体の細胞からでも劣性ホモの変異体が取れるというのが事実の示すところだと思います。

(無題) 削除/引用 No.1402-18 - 2008/06/23 (月) 15:57:15 - AP レポータ遺伝子の発現は遺伝子の発現量を定量的に評価できる、たとえば発現量が1/2になったとかを直接みることが出来るので、loss-of-functionのヘテロ接合でも見つけることができるでしょうね。 遺伝子機能の間接的あるいは総合的な結果である表現形で判定する場合、遺伝子量に敏感で判別しやすい表現形でないとむずかしいと思います。 その点、毒素を与えたときの生死という表現形だと難しいところがあるのではないでしょうか。遺伝子量が1/2になったからといって感受性がころっと変わるとは限らないですから。 うまいアッセイ系や条件設定ができればいいですが。

(無題) 削除/引用 No.1402-17 - 2008/06/23 (月) 14:23:07 - あいうえお 古典的な遺伝学的研究法ですね。 体細胞変異をＥＭＳでいれてその変異箇所を同定するのは 難しいです。 経験あります。ＣＨＯ細胞では変異体がとれました。 おそらくloss of functionだと思います。 そこからの解析としては、野生株のゲノムを 一本づつ変異株につっこんで、表現型復帰を見ていく方法 が妥当かなと。染色体を同定してからが難しいですが。 ゲノムトランスファーなどでぐぐってください。 この手をつかうくらいなら、ジーントラップをお勧めします。 レトロウイルスをゲノムの任意の箇所に挿入させて、 遺伝子機能をつぶす変異導入法です。 これならば、レトロウイルスの配列を基に つぶれた遺伝子を簡単に同定できます。 残念ながらＣＨＯ細胞はレトロの感染率が非常に低いので レトロウイルス受容体をＣＨＯ細胞に発現させるなど 工夫が必要ですが、こちらの方法のほうがはやいでしょう。 頑張ってください。

(無題) 削除/引用 No.1402-16 - 2008/06/23 (月) 13:29:56 - おお > ここまでサジェストしたらAcknoledgementくらいには入れて貰ってもいいかもしれませんね(笑)。冗談です。 じゃあ私はマテメソ書いてあげますので、コオーサーにしてもらいます。 (大冗談)

(無題) 削除/引用 No.1402-15 - 2008/06/23 (月) 13:01:33 - ~ siRNAライブラリーを入れて耐性になったものを取ってきてもいいかもしれませんね。 耐性株からcDNAやゲノミックライブラリーを作って、 親株に戻すというのは昔から行われていますが、 １．変異剤なしではほとんど耐性株が出てこない を確認したうえで、 ２．薬剤耐性が十分に強い株を取る(親株の2~3倍程度だと途中で耐性か分からない株が出てくる) のが重要です。 後、最近は何か便利なキットが出て早くできるのかもしれませんが、 おそらく卒研が終わるまでは、耐性になる遺伝子をクローニングするのは間に合わないと思います。

(無題) 削除/引用 No.1402-14 - 2008/06/23 (月) 11:44:13 - アイリ レポーター遺伝子の発現低下を指標に二倍体細胞から変異株を取って、発現クローニングで原因遺伝子を同定した仕事もありますよ。JAK、STATはそうやって取れたのだと思います。

(無題) 削除/引用 No.1402-13 - 2008/06/23 (月) 11:33:19 - AP うむ。受容体ねらいでなく、とにかく耐性遺伝子をとるというので立派にしごとになりますね（そうせ耐性になる突然変異は何の遺伝子にあたるかコントロールできませんし）。 EMSによる突然変異は主に塩基置換、それによるアミノ酸置換であり（転写調節の変異はあまり期待できない）、それによってGOF (constitutive) 変異が生じることは良くあります。これだと、耐性となる受容体の変異をとるというストーリーを全面に押し出すと無理がある（全く可能性がないわけではないでしょうが）ように思いますので、当面掲げるテーマは広く「耐性変異をとる」ということにして。 それであれば、皆さんの提案されている耐性変異体からライブラリーをつくって、トランスフェクションによって耐性を与えるクローンを同定するという、ストラテジーは攻めやすいと思います。 受容体下流のシグナルトランスダクションに関与する遺伝子でも見つかれば、そこから受容体にせまることも出来るかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1402-12 - 2008/06/23 (月) 10:40:19 - Caspase 1.EMSで耐性クローンを得る。 2.得られたクローンからcDNAライブラリーを作製、親株に遺伝子導入 3.毒素で耐性細胞を選択 4.導入遺伝子のシーケンス こんな感じでしょうか。 おおさんと同じですね(笑) ここまでサジェストしたらAcknoledgementくらいには入れて貰ってもいいかもしれませんね(笑)。冗談です。

(無題) 削除/引用 No.1402-11 - 2008/06/23 (月) 08:07:10 - おお >[Re:8] 理学部４年さんは書きました : > > するとなるほど、では君もEMSを細胞に振りかけて、毒で生き残ってくる細胞を一生懸命とって、取れたら発現クローニングやればいいよね。っていわれたんです。その時、自分は初めて発現クローニングを聞きました。 話の流れからして、EMSの変異で必ずしも変異の入った遺伝子を取ろうという感じでもなさそうかなともおもいます。EMSで何らかの遺伝子に障害がおこり、その結果ある耐性にかかわる遺伝子の発現のレベルが上がっているという事を期待しているのかもしれません。その場合耐性の細胞からcDNAをとり、感受性の細胞に発現させてやると耐性を獲得する細胞がいるのではという推測の元に実験が進めれるかもしれません。 耐性細胞からのcDNAから、感受性の細胞のcDNAをサブトラクションして、特異的遺伝子のライブラリーをえると言うても考えられます。それで感受性の細胞に入れればいいのですが、もうすこし簡略化することが出来るかもしれません。PCRをりようして、2つのcDNAからどちらかに特異的に発現する遺伝子をクローニングするような手法があります(クロンテックとかがキットを売っていると思います)。取れてきたクローンを感受性細胞に導入して強制発現して耐性になるかどうかをあとで調べるという方法がとれます。マイクロアレーを使えば特異的発現をしている遺伝子をグローバルな発現プロファイルから見つけることもできますね。 そういう観点であれば、cancer drugにたいする耐性獲得に関与する遺伝子を調べている論文は結構あると思いますので調べてみてはどうでしょうか。パットしない物は多いと思いますが、、、、 "発現クローニング"はその時何かイメージがあったのでしょうが、ちょっと本人でないと分からないですね。あまりとらわれずに、実験の可能せいをいろいろと考えていった方がいいのかなとおもいますが、、、 > 勉強になりました。４度でビオチン化毒素を細胞と反応させたあと、アビジン結合セファロースのカラムで回収してマスということでしょうか。プルダウンとは具体的にどのようなことか分かっていませんが。ありがとうございます。 ぷるダウンは免疫沈降やそれに類似する手法をいいます。レジンに抗体や、ターゲットにアフィニティーを持つものを吸着させ、ライセイトとインキュベーションし、遠心でレジンを回収するという方法です。お示しになっているカラムと求めているものは一緒だと思います。カラムのほうが量的には多くを処理できるかと思います。 > > Alu配列、初めて聞きました。有用のようですね、ぜひどんなものか調べてみます。 まうす3T3やラットRAT1細胞にがん遺伝子を持つであろうヒトゲノムDNAをトランスフェクションし、がん化した細胞を得て、その中に導入された人遺伝子を人特異的Aluをプローブに導入された遺伝子を見つけたという方法です。1980年後半ごろからポピュラーになったとおもいますが、、、、変異ras遺伝子などがこの方法でクローンかされています。

(無題) 削除/引用 No.1402-10 - 2008/06/22 (日) 23:44:03 - AP スクリーニングのストラテジーとしては、選択（毒素）をかけて生き残ってくるクローンを取るというのは理にかなっていますが、 ＞2Nの細胞で変異剤で叩いて耐性株を取ってくるということは、 gain of functionで取ってきていますよね。 毒素のレセプタをねらっている場合、GOF mutantというのはどういう状況が想定されるのでしょうか？？ より低濃度で死ぬ突然変異体をとるというのは考えられますが、うまいスクリーニングの方法があるでしょうか。 もしそれが可能なら、EMSなど使わずに、ライブラリーをトランスフェクションしてgene doseが増えたときに感受性が高まるクローンを取れば早いじゃない、と思えますが。

(無題) 削除/引用 No.1402-8 - 2008/06/22 (日) 21:16:19 - 理学部４年 みなさん 本当に勉強しなければなりませんね。 もう自分がとても恥ずかしいです。 でも本当にみなさん御丁寧な御回答ありがとうございました。 僕についている先輩は海外の学会に出張のため直接聞けません。 ただ、まだ細胞にEMSをかけてはいません。 ただ自分がこの実験を思い至ったのは、参考としている論文があったので、先輩のいない状態でしたが教授に聞いてみたんです。こういった論文がありますと。 するとなるほど、では君もEMSを細胞に振りかけて、毒で生き残ってくる細胞を一生懸命とって、取れたら発現クローニングやればいいよね。っていわれたんです。その時、自分は初めて発現クローニングを聞きました。 授業では一応、変異剤での処理は一倍体の細胞に用いられるということはならっていました。酵母やＣＨＯ細胞ですよね。 ですが、自分が参考にした論文はVero細胞（アフリカミドリザルの腎臓細胞）にEMSをかけて、毒に抵抗性を示す細胞を取っていました。 その時、ああ、この人たちは運よく２倍体なのに受容体もしくは毒素シグナルに重要な遺伝子が潰れてくれたんだなって思ってしまいました。 ですが、gain of functionの可能性の方が高いんですね。 勉強になりました。 教授も学生の僕の話はそれほどまじめに聞いてくれてなかったからかもしれません。自分が無知なので、もう一度自分なりに調べて自分の実験系に足りないものを考えていきたいと思います。 ありがとうございました。 おおさん >実際受容体があるということならば、その物質にビオチンのようなタグをいれぷるダウンし、取れてきたタンパクをマスで解析するという手法もあります。 勉強になりました。４度でビオチン化毒素を細胞と反応させたあと、アビジン結合セファロースのカラムで回収してマスということでしょうか。プルダウンとは具体的にどのようなことか分かっていませんが。ありがとうございます。 Alu配列、初めて聞きました。有用のようですね、ぜひどんなものか調べてみます。 発現さん、- ~ さん 変異導入に一倍体の細胞を用いるのは一般的なんですね、授業でならったのを忘れていました、ありがとうございます。 ＡＰさん 遺伝子同定法のひとつを教えていただきありがとうございます。 少し難しい内容ですが、調べてみます。 みなさん本当にありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1402-7 - 2008/06/22 (日) 18:30:43 - ~ 月曜日のうちに、この実験を指示した人に、内容を確認することをお勧めします。 2Nの細胞で変異剤で叩いて耐性株を取ってくるということは、 gain of functionで取ってきていますよね。 ２Nの動物細胞で遺伝子のアレル両方に変異が入ってloss of functionで取ってくるというのは、まずありえないと思います。 片方のアレルがつぶれることで若干耐性になったものをコスミド(cDNA)レスキューするのは、微妙な表現型の場合や、細胞老化まで期間などから難しいと思います。 Gain of functionであれば、 その耐性株でcDNAライブラリーを作って、 親株に入れなおして耐性株を取って、 入れた配列をPCRで回収するという実験系はあります。

(無題) 削除/引用 No.1402-6 - 2008/06/22 (日) 17:57:05 - AP それと、最近「次世代シークエンサー」呼ばれている大規模シークエンスのシステムがいくつか出てきていますね。委託事業をやっている企業もあるので、うまく変異体がとれたら、全ゲノムシークエンスを依頼するとか、、、、、

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