全10件 ( 1 〜 10 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.1397-10 - 2008/06/25 (水) 07:10:05 - グリセロールストックは廃棄 優秀な発現系はしばしば大腸菌がいやがる発現系でもあります。 大腸菌がいやがる発現系では、プラスミドは徐々に分解され、制限酵素パターンが汚くなっていきます。もしくは、チェックできない変異がはいるかもしれません。よって、発現効率が落ちた時点で、グリセロールストックは廃棄し、「オリジナルの構築したてのプラスミド」からトランスフォームするのが正統な方法と思っています。シングルコロニーをとるとらないは個人の自由です。 私はグリセロールストックは意図的にやりません。

(無題) 削除/引用 No.1397-9 - 2008/06/23 (月) 15:45:32 - 大腸菌 おおさん、Yさん、小腸さん、APさん、発現さん、たくさんのご意見を頂き有難うございます。 おおさん、Yさん >大腸菌を起こすときに、プレートに広げてシングルコロニーをつついてみてはどうでしょうか。 これは次に試してみようと思っています。私も個人的にはこの方が好きなのですが小腸さんがおっしゃっているように長期にわたって常に同じ条件で蛋白質発現を行うために今の方法を取っています。前培養後に予想されるODや発現にかかる時間などをそろえるためです。コロニーを拾う場合 大腸菌が元気なのでいいはずなのですが拾うコロニーの大きさによってその後のODなどにばらつきが出てきますよね。今の方法が上手く働けばその辺りを全く気にせず誰でも同じように同じ発現結果が得られるはずですから。 APさん >これって、溶かしたストックをいきなり液体培地に植えて培養していると言うことですか？ 上述したようにその様にしています。グリセロールストックが変わらなければ何時も同じ条件から始められる筈ですよね。そのメリットを取っています。 >pQEでタンパク質発現するときのホストはTG1で良いのですか？ 正直私はその辺りにあまり詳しくないのですが問題ないようです。他の蛋白質の発現にも使われていますが問題おきていません。 発現さん >プラスミドをトランスフォーメーションしてそのままラージスケールカルチャーして発現させています。 せっかくトランスフォーメーションするなら1日分手間ですがシングルコロニーを拾いたいところです。ただトランスフォーメーションなどを行うと稀に組み換えなどが起こることがありませんか？今のボスはもしトランスフォーメーションを行うならその辺りを再確認する必要があるのでやるなといっています。可能性は確かに低いでしょうが。

(無題) 削除/引用 No.1397-8 - 2008/06/22 (日) 08:08:49 - 発現 本題とは少しずれますが、、、 私は経代を繰り返すとタンパクの発現量が減る場合が多いので、シングルコロニーやグリセロールストックは一切作らず、プラスミドをトランスフォーメーションしてそのままラージスケールカルチャーして発現させています。OD値が重要な場合は10ml位で前培養してからラージカルチャーしています。 ストックを作ったり、プレートにまいて拾い直す手間が省けますし。

(無題) 削除/引用 No.1397-7 - 2008/06/22 (日) 00:27:16 - AP pQEは使ったことがないので勘違いしていたらごめんなさい。 pQEでタンパク質発現するときのホストはTG1で良いのですか？ T5プロモータで発現するシステムなので、T5 RNA polを有するプラスミド持っている系統（M15[pREP4] ）でなければならないのでは？

(無題) 削除/引用 No.1397-6 - 2008/06/21 (土) 19:44:52 - AP なぜかわからないけれど、ありますよね。グレセロールストックを起こして使うと妙に殖えが悪なっていてプラスミドの収量が悪いとか、融合タンパク質の発現が悪くなっているとか。ストリークしてシングルコロニーを拾うのだから、生きている細胞であるのは確かだし、分裂によって新生された菌を培養している訳なのですが。 原因を突き止めるとか、培養方法などで解決しようというより、プラスミドのストックがあればそれを使って、なければグリセロールストックから培養して取り直したプラスミドで、形質転換をやり直すというのが良いのではないでしょうか。 >前培養を準備する際は１チューブを使いきりにしています これって、溶かしたストックをいきなり液体培地に植えて培養していると言うことですか？　製薬会社標準かなにか知りませんが感心しないなあ。せめてシングルコロニーを取りましょうよ。 例えばですよ、グリセロールストックにするための培養をしている間や、培養を止めてバイアルに詰めて凍結するまでのタイムラグのあいだにプラスミドが抜けた細胞が出ないとは限らない、そういうのが混じった状態で液体培養したら、耐性菌によって抗生物質が分解されてきたときに、プラスミドのない菌と競合状態になるかもです。

(無題) 削除/引用 No.1397-5 - 2008/06/21 (土) 18:59:27 - 小腸 シングルコロニーからスタートするメリットは分かりますが、それは基本的にクローン毎に発現量のバラツキがあるということを前提としていますよね。複数のクローンを突っついて、それぞれに発現レベルをきちんと検討して・・・ということをする場合ならそれが正解だと思いますが、大腸菌さんの仰っている、ストックを細かく分注して毎回使い切りとすることで、何も変えずにルーチンで同じような発現を期待する場合にはよく使われる方法だと思います。 私も解決策を示すことができる訳ではありませんが、−80℃のフリーザーというところに引っかかります。特に開け閉めが頻繁な場合には、グリセロールストックの劣化は仕方がないのではないでしょうか。なるべく引出の奥に熱伝導の悪い素材にくるんで保存するか、できれば超低温フリーザーを使うのが良いのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1397-4 - 2008/06/21 (土) 06:03:19 - おお > でグリセロールでストックする時、ストックをつついて線画培養し、シングルクローンから始めると解決するとおもいます。私はなるべくいつもプラスミドから始めるようにしています。 でグリセロールストックを起こす時ストックをつついて線画培養し、シングルクローンから始めると解決するとおもいます。私はなるべくいつもプラスミドから始めるようにしています。 誤解が生じかねない表現でしたので、訂正しておきます。

(無題) 削除/引用 No.1397-3 - 2008/06/21 (土) 05:38:03 - Y 15% グリセロールで保存していますが、少なくとも数年は特に問題ありませんでした。おおさんのおっしゃることを考慮すると、大腸菌を起こすときに、プレートに広げてシングルコロニーをつついてみてはどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1397-2 - 2008/06/21 (土) 00:37:02 - おお 私は凍結保存された大腸菌は信用していません。よくプラスミドが抜けた菌ができたりして、そういう菌が優位に増殖したりして、目的の菌がどんどん減っていくような感覚があります(すべてにおいてではありませんが)。多分凍結保存じたい、ある意味大腸菌にストレスなのでしょう。 でグリセロールでストックする時、ストックをつついて線画培養し、シングルクローンから始めると解決するとおもいます。私はなるべくいつもプラスミドから始めるようにしています。

-80度で保存されたGSの安定性 削除/引用 No.1397-1 - 2008/06/20 (金) 22:15:20 - 大腸菌 今いる研究室で現在主に使っているリコンビナント蛋白質のストック 管理を任されています。私が主に発現系、精製系の確立に関わったのが その理由です。発現系は大腸菌で2年ほど前に準備したグリセロール ストックを300チューブに分注し-80度フリーザーに保存してあります。 前培養を準備する際は１チューブを使いきりにしています。 この方法は長期にわたって大腸菌の発現系維持する場合に製薬会社が 一般的に使っている方法なのだそうです。 最近1年ほど前に発現させておいた菌体が底をついたため新たに培養を 行ったのですが、最近培養した３ロット全てで十分な発現が見られません でした（ウエスタンで過去のロットと比べることによって確認しました）。 振とう器の温度や回転スピードに問題はありませんでしたし、もちろん 試薬のロットが変わってはいるものの1年前と同じメーカーの同じ製品を 使って液体培地を準備しています。過去にも十分な発現量を得られ なかったこともありましたが３ロット連続して十分な発現量が得られ なかったことはありません。私がお聞きしたいのはこのような方法で グリセロールストックを−80度で保存しておけば何年にも渡って同じ 大腸菌の発現系を維持できるのでしょうか。どなたか同じような トラブルにあわれた経験やその他なにかご意見などがありましたら レス頂けませんか。宜しくお願い致します。 大腸菌　　　　　　：TG1 発現ベクター　　　：pQE(Qiagen) グリセロール％　　：10% 保存　　　　　　　：-80Cで2年間（現在まで） 培地　　　　　　　：2xYT

全10件 ( 1 〜 10 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---