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(無題) 削除/引用 No.1394-11 - 2008/06/27 (金) 14:24:01 - 染色体 返答を書き込んだつもりでしたが、消えてますね？？4については、その通りです。そもそも一度、1次抗体で反応させて2次抗体で可視化して、なぜ次に別の2次抗体+2次抗体が使えないかというと、最初に使った1次抗体が完全に2次抗体でブロックされず、また、解離もするので、2回目の2次抗体が結合するからです。 それで、最初の1次抗体を2次抗体でマスクして、以降の抗体反応からは立体障害で見えないようにしてPFAで固定して解離もしないようにすれば、同じ種の抗体でも使えるだろうという理屈です。このやり方は、論文で使ったこともありますが、未標識抗体でのブロックさえちゃんとやれば、大体うまく使えますよ。

(無題) 削除/引用 No.1394-10 - 2008/06/25 (水) 18:19:04 - 多重染色 染色体さま ４番目の手技（PFAとアミノ基のあたり）が分かりにくいのですが、未標識抗マウス抗体で１次抗体をブロックしながら次々と多重染色していく、との理解でよろしいでしょうか。 seaさま 表現が悪く、申し訳ありませんでした。２種類とも同じクラスの抗体ですが、IgGではなく、これらを標識するzenonがカタログに載っていなかったので使えないと判断しました。

(無題) 削除/引用 No.1394-9 - 2008/06/25 (水) 04:27:42 - sea クラスが違う、というのは使っている抗体のうち一つが IgGでもう一つがIgMだった、とかそういう状況ですか？ ならば何も悩む必要はないような気がしますが。 先日も書いたようにサブクラスが違うのであっても サブクラス特異的抗体が使えると思いますし。 2ndAbはさほど高価じゃないのでreasonableな選択だと思いますけどね。

(無題) 削除/引用 No.1394-8 - 2008/06/24 (火) 23:46:15 - 染色体 Zenon使わなくても、未標識の抗マウス抗体さえあれば同一種抗体で2つの免染ができますよ。やり方は以下の通りです。 1.普通に最初の抗体と反応させ2次抗体まで反応させ、普通に洗浄まで行う。 2.高濃度の未標識抗マウス抗体（0.1mg/ml程度）で1時間室温でincubateさせて、完全に1次抗体をブロックする。 3.PFAで普通に固定を1時間する。 4.あとは普通に、PFAをアミノ基をつぶしたあとで、2回目の抗体で免染を行う。

(無題) 削除/引用 No.1394-7 - 2008/06/24 (火) 23:26:24 - 多重染色 名無しさま、発現さま 貴重な情報、ありがとうございます。 しかし、当方の確認ミスにより抗体のクラスが異なるためにzenonを使えないのではないかと考え、現在、別の手段を考えています。貴重な情報を役立てることができず、誠に申し訳ありません。

(無題) 削除/引用 No.1394-6 - 2008/06/22 (日) 16:47:10 - 発現 培養細胞の二重蛍光抗体染色でzenonは普通に使えました

(無題) 削除/引用 No.1394-5 - 2008/06/22 (日) 13:39:49 - 名無し ICCですがZenonを使った事があります。 問題なくデータを取れましたし、簡便で気に入っています。

(無題) 削除/引用 No.1394-4 - 2008/06/22 (日) 09:09:52 - 多重染色 よっしー様、sea様 さっそくのアドバイス、ありがとうございます。 当初、蛍光を考えていましたが、ビオチン化で検討したいと考えています。

(無題) 削除/引用 No.1394-3 - 2008/06/21 (土) 05:21:17 - sea zenonは使ったことありませんが、 Fab抗体を使った二重染色の方法がしたのページに解説してあり、 参考になるかもしれません。 Jackson ImmunoResearch http://www.jacksonimmuno.com/technical/fab-blok.asp それから、マウス由来、ということはほぼモノクロですよね。 それぞれの抗体のサブクラスが違えばサブクラス特異的 二次抗体も使えるかもしれませんね。 検出系はbiotin とAP、もしくはbiotin-biotinでも 途中でbiotin blockingをかませば使えます。 二次抗体のcross reactivityの可能性などを否定するために それぞれの一次抗体を省いたcontrolをとることを忘れずに。 で、蛍光染色じゃないんですよね？

(無題) 削除/引用 No.1394-2 - 2008/06/20 (金) 19:37:34 - よっしー zenonは使ったことありませんが， 私なら，ひとつをビオチン化します(安いし簡単)． 未標識1次抗体，ビオチン以外の標識抗マウスIg抗体，ビオチン化1次抗体， 標識ストレプトアビジン の順にすると可能だと思いますが．

ヒト組織をマウス由来の抗体で多重染色 削除/引用 No.1394-1 - 2008/06/20 (金) 18:52:17 - 多重染色 よろしくお願いします。 ヒトの組織を免疫染色しようと思っています。 ２種類の蛋白を、ともにマウス由来の抗体で染めたいのです。別の動物種の抗体を新しく買うぐらいなら、信頼できる今の抗体を使いたいという理由です。 そこで、invitrogen社のzenonを考えてますが、使われた方、もしくはもっと別の手技をご存知の方、アドバイスをいただけませんでしょうか。

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