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PLP固定も念頭に入れたいと思います 削除/引用 No.1392-8 - 2008/06/23 (月) 09:31:50 - セラマイド PLP固定というのは知りませんでした。膜や糖が固定されるのであれば、目的に合致しているかもしれません。 というのは、ターゲットはBODIPY-Ceramideですが、 モノを細胞に取り込んだ後の代謝・輸送経路として、 �@ゴルジ体に移行 �A糖代謝（グルコシルセラミド） �Bトランスゴルジを経て小胞輸送（この時、小胞中にターゲットタンパクとBODIPY-glucocylceramideが内包されている) を考えております。 糖も膜も固定されるのであれば、その小胞も固定されやすいだろうと思いますますので、試してみる価値がありそうですね。（抗体が小胞の中に入るかは分かりませんが・・・） また、BODIPYよりもNBDのほうが適している可能性についても検討余地がありそうですね。

(無題) 削除/引用 No.1392-7 - 2008/06/22 (日) 16:08:27 - PFA PFAの反応はかなり複雑ですが、primary amineが主であるのは確かと思いますが、BODYPIC5ceramideにはprimary amineは含まれていないので、固定前にBodypyceramideを加えて固定してTriton処理するのは無理っぽいです。ただ、固定後の細胞を染めることはありえますが、seaさんの書かれたように、BODYではだめで、NBDは良いとMPのハンドブックに書いてありますね。 APさんの書いておられるPLP固定、免疫電顕でひところ一世を風靡したやり方ですね。これは光顕でも使えますか、なるほど考えてみませんでした。確かに過ヨウ素酸で糖も結合できるので、PFAだけより良さそうです。でも単純な脂質は無理そうですね。今度やってみます。

(無題) 削除/引用 No.1392-6 - 2008/06/21 (土) 18:36:56 - sea 仕様経験はないので実際的なことは何もいえないのですが、 ひとつ気になるのは、この製品のマニュアルには このBODIPY-C5-Ceramideはlive cell imagingに適している、と 明記されていて、固定された細胞の染色には NBD-C6-Ceramideを使え、と書いてある点です。 http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp01154.pdf (注：PDFです) ＜抜粋＞ Staining the Golgi Complex in Fixed Cells with NBD C6-Ceramide It has been reported that NBD C6-ceramide is suitable for staining of fixed cells, but that BODIPY FL C5-ceramide and BODIPY TR ceramide are not. Conditions for staining appear to be generally noncritical. However, detergents and methanol/ acetone fixatives should be avoided. Live cellに取り込ませた後で固定して観察したい場合はどうか、 ということは記載されていません。 Dyeとしての性質の違いも色々あるみたいですが、 使う製品を買える、というのも一つの手かもしれません。 この製品にこだわるんであれば、たぶんプロトコルを確立して Invitrogenにそれを知らせてあげると、Invitrogenに喜ばれるかも しれません。 なんか使用例を教えると抗体一個無料で進呈！みたいな特典が Invitrogenにもあるといいんですがー

(無題) 削除/引用 No.1392-5 - 2008/06/21 (土) 17:04:52 - AP 単純に、界面活性剤を使わずに浸透化するというところだけに目がいっていました。膜系と細胞質系両方を満足させる免疫染色は難しいですよね。 PLP固定は期待できる方法のひとつです。膜、糖質が良く固定されるので、膜抗原が抜けにくいです。オールマイティではないにしても、多くの場合、界面活性剤による浸透化に耐え抗原性も保持されます。 原著はこれ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/4374474 多くの実験書、文献、ウェブ上に使用例やプロトコールが見つかると思います。 >それはさん >PFA固定ではなくホルマリン固定はやってみましたか？ どっちもformaldehyde水溶液ですよね。PFAは水に溶かすと加水分解してformaldehyde monomerになります。 formaldehyde水溶液は不安定で劣化しやすく（ギ酸を生成する）、また水溶液で供されるフォルマリンは安定剤として不純物（メタノールなど）を含むため、抗原性などに悪さをすることがあるので、その都度PFAを溶かして使うのが好まれるというだけで、本質的には違わないはず。

(無題) 削除/引用 No.1392-4 - 2008/06/20 (金) 22:46:58 - それは PFA固定ではなくホルマリン固定はやってみましたか？ 僕も糖脂質を染めたりしていますので参考になります。

(無題) 削除/引用 No.1392-3 - 2008/06/20 (金) 22:37:52 - セラマイド ご意見ありがとうございます。 メタノールやアセトンなどの有機溶媒系は、脂質が溶出するためか、蛍光標識セラミドがすべていなくなってしまいました・・・。 マイルドな界面活性剤を試す価値はありそうですね。 今のところ、サポニン、ジギトニンが手元にありますのでそれで試してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.1392-2 - 2008/06/20 (金) 18:22:05 - AP メタノール系の固定（冷メタノール、メタノール酢酸、Methacarnなど）や冷アセトンの固定ではどうでしょうか。一般的に、界面活性剤による浸透化処理をしなくても浸透性が得られるとされています。 浸透化処理の界面活性剤をスキップしても、抗体希釈液や洗浄液にTriton X-100やTween-20が入っていると抜けてしまうタンパク質もあります。界面活性剤を抜くか、もっとマイルドなサポニンに替えたほうがいいかもしれません（浸透化にサポニンは使えないと思います）。

培養細胞内の蛍光標識セラミドを溶出させずに免染する方法 削除/引用 No.1392-1 - 2008/06/20 (金) 18:01:15 - セラマイド 蛍光標識セラミド(BODIPY-FL-C5-Ceramide インビトロジェン）を細胞に取り込ませた後、PFAで固定し、別のタンパクの免疫蛍光染色を行いました。目的は、蛍光標識セラミドと目的タンパクの共局在を調べることです。 PFA処理のみだと、固定前と比べて蛍光セラミドの細胞内局在に変化はなかったのですが、免染してもタンパクは染まりませんでした。 そこで、抗体の浸透性を高めるため、Triton-100を用いて膜透過性を高めた結果、 タンパクは染まったのですが、蛍光標識セラミドのインテンシティが下がり、さらに局在も変化しました。 おそらく、界面活性剤と反応したか、溶出してしまったと考えてます。 目的である蛍光セラミドとタンパクの共局在を調べるために、界面活性剤の種類を変えてもう一度やってみようと思ってますが、 他にもっと良い方法はございますでしょうか？ ご存知の方がいらっしゃいましたらご助言いただきたいと思います。

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