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(無題) 削除/引用 No.1385-7 - 2008/06/21 (土) 03:23:42 - おお DNAはゲノムだとおもっていますがだ生物種にもよりますが、プライマーで増幅される場所がイントロンでさえぎられていることはないですよね。 あと、DNAは希釈後に測るのもできるのでは? 10ng/ugの濃度であればOD値0.2でじゅうぶんはかれるのうどです。 あととれたDNAを0.8%のアガロースでながして、DNAのクオリティーなどをチェックしてみてはどうでしょうか?

Re: 削除/引用 No.1385-6 - 2008/06/20 (金) 22:20:47 - UC （最初と質問の趣旨が違うような気もしますが） ＞濃度測定したときには、 ＞希釈溶液にDNAが必要量含まれていない可能性を疑っています。 　１．どういう測定方法なのか？ 　２．A260/A280などの値は？ 　３．RT-PCRとPCRのプライマーは別のものなのかどうか。 この辺りを明確にすると、回答が得られると思います。希釈に関しては DNA原液がちゃんとしたものであれば、それを1/10 TEなり水なりで希釈 すれば、全く問題ないと思いますが。

(無題) 削除/引用 No.1385-5 - 2008/06/20 (金) 20:52:39 - DNA ご回答ありがとうございます。 具体的に気になっていることは、RNAとDNAの処理の仕方です。 理由としては、濃度測定したときには、それぞれその存在を確認してるのですが、 DNAに関しては、濃度が濃かったので、約10倍くらいに希釈していますが、 その希釈がうまくできていない可能性、 つまり、希釈溶液にDNAが必要量含まれていない可能性を疑っています。 なので、原液や希釈時のＤＮＡの溶解を均一にするためには、皆様がどのように行なっているかを確認したくて質問しました。 私は、DNAは某社のプロトコールに従い8mM NaOHで溶解し、RNAはDEPC waterに溶解しています。 DNAの希釈は、問題ないかと思いましたので、DEPCwaterにて原液を希釈して使用しています。 加熱処理などは、それぞれ使用直前にのみ5min程度行なっています。

(無題) 削除/引用 No.1385-4 - 2008/06/20 (金) 15:07:24 - おお >[Re:1] DNAさんは書きました : > RNAとDNAでは、処理の方法、例えば溶解方法や溶媒など、は違うのでしょうか? それを問うのであればあなたがどのようなバファーを使って、どうしたのかなど要所々々を提示してはどうでしょうか。あるいはどの処理がきになるとか。 この質問で答えるとすれば、ほとんど一緒ですとしか答えようがありません。ま、実際ほとんど一緒ですが。 > それとも、単に実験手技のミスでしょうか? 実験手技のミスは実際に見てないと指摘できません。あるいは具体的にどうしたのか書いてもらわないと、、、、 ひとついえることは、ゲノムのPCRとRTのPCRでは、PCRの環境が違います。たとえば、ゲノムは転写される以外の物も含まれます。配列の複雑性はRTプロダクトより大きいといえると思います。そうするとDNA(ゲノム)の方がかかりにくいとも思えます。色々な違う理由でRNAの方がかかりにくいと思うこともあるかと思います。 言いたいことはそれぞれPCRの条件を最適化してください。もし無理か、条件検討ではまりたくないのであれば、ゲノム用に違うプライマーをデザインしてみてはどうでしょうか。 あとDNAの溶液のアルコールなどのコンタミとか純度(PCRなのでそんなに純度はシビアーではないですが)などはどうでしょうか。なにかいままであなたの研究室でゲノムのPCRに使ったプライマーでワークするものがあればポジコンになると思います。 ヒトゲノムでもPCRにつかうサンプルは10ngもあれば大抵の場合十分であまり多いとノンスペやかかりにくい原因になり得ます。

(無題) 削除/引用 No.1385-3 - 2008/06/20 (金) 15:03:37 - 774 長いイントロンをはさんでプライマーを設計してるのでは？

(無題) 削除/引用 No.1385-2 - 2008/06/20 (金) 14:50:30 - Mac 分解されやすさの違いはありますが、RNAをRTした時点で性質は両方とも同じになります。 確認されるべきことは、RNAが本当にRTされているか、DNA（ゲノム？）がきちんと取れているか、プライマーの設計、反応液の組成、テンプレート量、アニーリング温度、cDNAをテンプレートにしてPCRで増えたものが予想されるバンドサイズだったか、などでしょうか。 片方が増えないということから考えると、テンプレートが怪しいんじゃないでしょうか？

DNA RNAの処理について 削除/引用 No.1385-1 - 2008/06/20 (金) 13:56:05 - DNA 現在DNAとRNAの両方を使って実験を始めた初心者です。 DNAとRNAを精製したあとで、RNAはRTをした後にPCRをし、DNAはそのままPCRを行なっています。 RNA(cDNA)の方はPCRのバンドが見えるんですが、DNAの方はノンスペのバンドすら見えません。 プライマーの認識部位は確認済みですし、配列にも問題ないと思うのですが、よく分からないので質問しています。 RNAとDNAでは、処理の方法、例えば溶解方法や溶媒など、は違うのでしょうか? それとも、単に実験手技のミスでしょうか? 漠然とした質問ですが、お願いします。

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