アフィニティー抗体カラムの初心者です。
ご意見の程、よろしくお願いいたします。
NHSに抗体を結合させたアフィニティー抗体カラムを作成しました。
次に、細胞溶解液（1%Triton-X100溶液で溶解）から抗原を精製したいと考えています。
そこでいくつか疑問点があります。
@細胞溶解液を、カラム担体（NHSのリガンドをブロッキングしたもの）でプレ処理してから、抗体カラムにアプライしている論文がいくつかあります。不純物の高い細胞溶解液をいきなり抗体カラムにアプライすると汚れるし、精製純度が低下するからだと思いますが、このステップはプレカラムを一度通すだけでよいでしょうか？論文では4℃、O/Nでプレカラムを循環させていますが、ペリスタ−ポンプがないのでできません（プレカラムは作成済み）。ゲル担体を購入して転倒混和した方がいいでしょうか？また、プレ処理を実施しないで抗体カラムにアプライするのはやめた方がいいのでしょうか？
Aカラムにアプライするタンパク濃度はどの程度がいいでしょうか？濃すぎると結合能が低下するので薄めたいと思っています。
B溶出した後、質量分析を実施したいので、塩や界面活性剤の除去が必要です。そこで、細胞溶解液をアプライし、1%Triton-X100溶液でカラムを洗浄した後、精製水で洗浄して、TFA（pH2.0）で溶出するという方法は可能でしょうか？通常通り、0.1M グリシンで溶出した後、脱塩した方がいいでしょうか？ |
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