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哺乳類細胞株における組み換えタンパク発現 トピック削除
No.138-TOPIC - 2007/08/30 (木) 17:49:12 - His
非常に基本的なことで申し訳ないのですが、、、
HeLaなどのヒト細胞株にHisタグ付き全長ｃDNAを含むベクターをトランスフェクションし、M-PERなどの試薬でcrudeのライセートを回収後、市販のニッケルカラムを使用して組み換えタンパクの精製を予定しております。
注意した方が良い点や参考になるプロトコールをご存じありませんでしょうか？また、（細胞株や発現させるタンパクの種類によると思いますが）1x10^6程度の細胞からですと何μgくらいのタンパクが回収できますでしょうか？

タンパク実験の経験が乏しいため、何かご存じの方がいらっしゃいましたら、アドバイスお願いします。
　
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いまさらですが・・・ 削除/引用
No.138-9 - 2008/02/29 (金) 09:38:35 - Tommy Ron
ご質問を見ていまさらですが投稿させていただきました。タイテック社のCO2-BR（CO2環境下で振とう培養できるシェーカー）がインビトロジェンの推薦商品になっています。タイテックという装置メーカーか、インビトロジェンに問い合わせれば詳細が聞けますよ。http://www.baiyou.jpというサイトにもデータが載っていました。ではでは。

(無題) 削除/引用
No.138-8 - 2007/09/04 (火) 12:42:46 - ats
回転培養ができるシェーカーをCO2インキュベーターの中に入れて使っています。
dispoのフラスコを使っていることおよび培地が高価なので、コストは高いです。
また、８％CO2で培養するのでFreeStyle専用CO2インキュベーターになることも考慮したほうがよいです。293細胞をひたすらdish培養して、BBSを利用したリン酸カルシウム法で行うのが安価でした。
harvestが面倒でした。洗浄した細胞をdishごと-80Cにいれ、後日溶解液で回収したこともあります。

(無題) 削除/引用
No.138-7 - 2007/09/03 (月) 18:03:02 - His
返事が遅くなって申し訳ありません。
みなさんご回答ありがとうございました。

InvitrogenのFreestyle293は気になっておりました。
ただ、振とう培養のできるCO2インキュベーターが無いので、
ちょっと迷っています。
スターラーバーなんかを使って代用できるのでしょうか？
あるいは、普通のHEK293を使って接着培養した方がましでしょうか？？

聞きかじりですが 削除/引用
No.138-6 - 2007/08/30 (木) 21:16:07 - 通りすがり
Roche社のAnti-His6（2）だとかなりノンスペが減少するようです。

(無題) 削除/引用
No.138-5 - 2007/08/30 (木) 19:15:07 - ~
293細胞はトランスフェクション効率が高いのでよく使っていました。

プロモーターや発現させる遺伝子にもよるのでしょうけど、
1*10^6だと、1/10量以下でWBでは十分見ることが出来ましたが、
co-IPで何かを拾ってくるときには全く足りない量でした。

(無題) 削除/引用
No.138-4 - 2007/08/30 (木) 19:10:30 - ats
経済的／装置に余裕があるなら、InvitrogenのFreeStyle CHOや同293が超富栄養培地での浮遊培養系も考慮にいれてもよいかと。
細胞数が稼げます（〜10^7/ml）ので、量をとるのには楽ですが、kitや培地が高価です。
コンタミさせやすいので、購入後のStockを作るまでの培養にはPenicillin/Streptomycinの使用をお薦めします。
もっとも、所詮培養細胞なので、取れるタンパク量は知れています。ベクター／細胞／タンパクの種類によって100倍くらい差がありますね。

(無題) 削除/引用
No.138-3 - 2007/08/30 (木) 18:51:59 - 通りすがり

参考になるかどうかわかりませんが、
動物細胞での場合は大腸菌とかと違って
Hisタグやニッケルなどでの回収は非常にノンスペが多く
(そもそも動物細胞ではHisx6を含むタンパクが内在性にかなりの種類存在します)
やるとわかりますが、めちゃめちゃ不純物だらけで精製度は低くなりますし
回収率もそんなによくないです。


回収量はタンパクの種類とかvectorのpromoterとかによって
違うので答えられませんが
とりあえずHeLaで通常のtransfectionなどでtransientにやった場合
1x10^6程度からでは少ないはずで、
ugとかはいかない場合がほとんどじゃないでしょうか。
数十ngとかでないかな?

追加 削除/引用
No.138-2 - 2007/08/30 (木) 18:12:52 - His
追加で申し訳ありません。
もう一点、組み換えタンパクの発現に
お薦めのヒト細胞株などありましたら、お教えください。

哺乳類細胞株における組み換えタンパク発現 削除/引用
No.138-1 - 2007/08/30 (木) 17:49:12 - His
非常に基本的なことで申し訳ないのですが、、、
HeLaなどのヒト細胞株にHisタグ付き全長ｃDNAを含むベクターをトランスフェクションし、M-PERなどの試薬でcrudeのライセートを回収後、市販のニッケルカラムを使用して組み換えタンパクの精製を予定しております。
注意した方が良い点や参考になるプロトコールをご存じありませんでしょうか？また、（細胞株や発現させるタンパクの種類によると思いますが）1x10^6程度の細胞からですと何μgくらいのタンパクが回収できますでしょうか？

タンパク実験の経験が乏しいため、何かご存じの方がいらっしゃいましたら、アドバイスお願いします。
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