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(無題) 削除/引用 No.1378-7 - 2008/06/21 (土) 03:14:08 - おお >[Re:6] こさんは書きました : > 今回あらかじめ位置を変えて４つのプライマーを設計しました。 > そしてすべてのプライマーでそれぞれ予想されるサイズのバンドを得られました。 > さらに制限酵素で確認する必要性はあるのでしょうか？ シーケンスがかからない事態をどう考えるかということだと思います。バンドを切り出したにもかかわらずPCRがかかっていないという主張があるわけですから、かかっていると納得させる(自分が納得する)材料が欲しくないですか。かかっていても、ノンスペが同じところに増えていてシーケンスのじゃまをしているかもしれません。波形データーは見ましたか。 あと、4つのプライマーを使ってシーケンスしてすべてかからない(ノンスペが増えていたとしてもそのシーケンスが読めたりする場合もあります)のであれば、何かほかの所に原因があるかもしれません。 たとえばプラスミドにほりこんでからT7などでシーケンスしてみてはどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1378-6 - 2008/06/20 (金) 22:48:44 - こ 今回あらかじめ位置を変えて４つのプライマーを設計しました。 そしてすべてのプライマーでそれぞれ予想されるサイズのバンドを得られました。 さらに制限酵素で確認する必要性はあるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1378-5 - 2008/06/20 (金) 09:55:05 - おお まずバンドが特異的かを判断する材料が欲しいです。PCRしてアガロースの電気えいどうでそれらしいところにバンドが出てそれで実験を進めていこうとして次の実験を仕掛ながら、シーケンスをしたら、全然違う配列だったということがあります。バンドは一見それらしいサイズでその他に非特異な増幅は見られなかったのですが、それらしいバンドも非特異な増幅でした。 シーケンスで確認するのはいいのですが、その前に制限酵素などで予想したサイズのバンドが現れるかなどやってみてもいいかもしれません。4ベースカッターならそこそこ切れるところが見るカルト思いますし。 あと、シーケンスはそんなに複雑性のたかいところからPCRのように増幅するものではありませんので、アニーリング温度で細かく条件を検討しなくてもかかる場合がおおいです。シーケンスとちゃんと取れてなかったという事態を考えて念のために少し違うプライマーを設計してみてはどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1378-4 - 2008/06/20 (金) 09:07:10 - + >同じプライマーを使用している以上アニーリング温度を変える理由が私には わかりません。。。 PCRの反応液の組成と、シーケンシング反応液の組成が違えば、至適アニーリング温度の計算値が多少は変わるかもしれません.... が、一番の理由は、 他の客から受託しているサンプルと同時にシーケンシング反応を行う都合上、アニーリング温度を指定しているのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1378-3 - 2008/06/20 (金) 00:59:41 - こ 検討します。 しかし実際シークエンス反応時のアニーリング温度ってかなり ゆるいきがするのですが、、、 増幅のために用いるＰＣＲ時のアニーリング温度と同じ ではだめなのでしょうか？ 同じプライマーを使用している以上アニーリング温度を変える理由が私には わかりません。。。

(無題) 削除/引用 No.1378-2 - 2008/06/19 (木) 23:13:01 - ~ 受託業者はPCRがかかっていないとしか言ってこないのですか？ ろくなトラブル対応ができない業者が問題だと思います。 業者を変えてはいかがでしょうか。

ダイレクトシークエンス 削除/引用 No.1378-1 - 2008/06/19 (木) 21:41:56 - こ PCRで目的のバンドが出ずにいろいろやって、結局タカラのprimeSTARを 使ったらあっさり出たのはいいのですが、ゲルを切りだしてダイレクトシークエンスを外注したところPCR反応がかかっていないと言われました。 私が気になっているのは、シークエンス反応時のアニーリング温度がPCR増幅時の温度と異なっているため（外注先が温度を指定しているため）と考えているのですが、、、、 それともプライマーの問題なのでしょうか？

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