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(無題) 削除/引用 No.1371-19 - 2008/06/20 (金) 18:12:40 - よっしー > 例えば50 ml tubeにイソプロを100 %でつめて、そこに細胞の入ったcryo tubeをポチャンと入れ、 > フタをして-80℃に入れればゆっくり固まってくれるということなのでしょうか？ それはどうなんでしょう？万が一チューブの中にイソプロが入っても困りますし． やってみないと分かりません．

(無題) 削除/引用 No.1371-18 - 2008/06/20 (金) 18:01:58 - ami nalgeneのMr.Frostyがいいです。だいたい-1℃/minくらいでゆっくり固めてくれるとのこと。-20℃のステップいらないです。

(無題) 削除/引用 No.1371-17 - 2008/06/20 (金) 14:22:00 - ソン 早速の返答ありがとうございます。 うちではバイセルは高くてありません。 なので、よっしーさんのアドバイスを頂いて、 例えば50 ml tubeにイソプロを100 %でつめて、そこに細胞の入ったcryo tubeをポチャンと入れ、 フタをして-80℃に入れればゆっくり固まってくれるということなのでしょうか？ 何度もすみません。お時間があるときにご回答頂けると嬉しいです。

(無題) 削除/引用 No.1371-16 - 2008/06/20 (金) 13:50:18 - よっしー 私の使っているものはnalgeneのミスターフロスティーです． 先ほどはこれのことをイソプロボックス？と言いました． バイセルはイソプロが入ってるのかどうかは知りませんが， 周りにもっと粘性の高い，冷蔵品の納入の時に入ってる保冷剤(ゲル状の物) のようなものが入ってるのじゃないでしょうか．

(無題) 削除/引用 No.1371-15 - 2008/06/20 (金) 12:09:55 - ソン イソプロボックスというのがバイセルの本態なのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1371-14 - 2008/06/20 (金) 11:18:09 - よっしー 私もATCCで細胞を分与してもらってから，5%DMSOでストックしてました． 当時はプログラムフリーザーで凍らしていたためか，うまくストック出来ていました． 今のラボはプログラムフリーザーが無く，イソプロボックス？ でストックしていますが，起きが悪い様な気がして10%に戻しました． 厳密に比較したわけでなく，原因がDMSOの濃度なのかどうかは分かりませんが， 凍らせる方法により，5%DMSOではまずいのかもしれません． 全く根拠の無い，感覚的な話です．

(無題) 削除/引用 No.1371-13 - 2008/06/20 (金) 10:56:23 - mom-a 解決済みになってますが。 ＞DMSOさん 私もそのまま培養するのと、遠心するのと両方やったことがあります。線維芽細胞とかガン細胞だったせいかもしれませんが、どちらでも問題なく起きました。大抵の場合は、上手く起きることが経験的に分っている方法に従っているのだと思います。ちなみに、起こすときに遠心する場合は、培地で10倍にしていました。 ただ、細胞を購入した場合（JCRBとか、KURABOとか）、大抵は起こす時に遠心するように書いてあるような気がします。特に、DMSOで分化誘導がかかる細胞の場合は（HL-60など）上清をきちんと除くようにという注意書きがあったと記憶しています。細胞によりけり、という部分については細胞をくれた人（あるいは販売元）の指示に従うのが一番だと思います。 おおさんの書き込まれた5%DMSOでストックされているという件は全く知りませんでした。10%が標準だと思い込んでいました。最初から下げられるなら、それにこしたことはないかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.1371-12 - 2008/06/20 (金) 08:46:45 - おお 解決済みですが私も。 ATCCのホームページをみますと、たいていの細胞のストックにDMSO 5%と書いています。私は5%で保存したことはないのですが、DMSOに対する細胞の影響がありそうなら10%から下げてみるのもてかと思います。

凍結細胞の起こし方 削除/引用 No.1371-11 - 2008/06/20 (金) 06:56:58 - DMSO 既に解決済みのところへ投稿してしまいますが、よろしくお願いします。 細胞の凍結に関してですが、液体窒素からバイアルを取り出して起こす時、皆さんはどのようにされているでしょうか？ 私は「DMSOが細胞内に入ってる状態で遠心すると細胞がダメージを受けるので、まずは大量のメディウム（通常使用量の倍程度。10cmディッシュで20ml位）に起こして、翌日にメディウムチェンジした方が良い」と習い、これに従っています。amiさんのやり方と同じでしょうか。 しかし、別の知り合いに言わせれば培養液中にDMSOを残すほうが良くないから、起こす時に遠心（5ml程度のメデイウム中に入れ、遠心）してしまうという意見もあるようです。 実際に両方で試してみたことがありますが、強い細胞だったせいか特に問題無く両方のやり方でほぼ全ての細胞が起きました。 弱い細胞ではこうやって起こした方が良い、といったことをお知りの方がいらしたら、ご教授いただけないでしょうか？よろしくお願いします。

ありがとうございました 削除/引用 No.1371-10 - 2008/06/19 (木) 23:28:18 - Postgrad 10％DMSO-90%FBS,1x10^6Cell/ml、-20度→-80度→液体窒素で試してみます。 たくさんのアドバイス、ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1371-9 - 2008/06/19 (木) 22:24:09 - -- amiさん isopropanol boxというものについて詳しく教えて頂けませんでしょうか？ 一体どういったものなのでしょう？

(無題) 削除/引用 No.1371-8 - 2008/06/19 (木) 22:23:24 - himawari 初代（血管）平滑筋細胞の使用経験があります。 通常の培地（DMEM + 10%FBS)にDMSO(final conc.10%)加え、-80℃→液体窒素保存でviabilityが70%ぐらいです。 凍結保存する際の細胞数は1x10^6cells/mlで問題ありません。 以上参考になれば。

(無題) 削除/引用 No.1371-7 - 2008/06/19 (木) 22:11:22 - ami ある細胞が、凍結に弱いといわれていて、でもどうしても凍結したいという状況でしたら、10% DMSO、90% FBSに懸濁して、バイセルとかIsopropanol Boxみたいなのに入れて凍結するのが、安牌だと思います。 起こすときは、37℃のWater Bathで、全部溶ける寸前まで溶かして、一片の氷が残っている状況で20倍量くらいの培地に入れてから培養にもっていくとよさげです。

(無題) 削除/引用 No.1371-6 - 2008/06/19 (木) 18:55:54 - ~ >懸濁、→液体窒素 いきなり液体窒素に入れるというプロトコルだったのですか？ 平滑筋ではそのような凍結保存法があるのでしょうか？ 前任者の凍結に弱いという情報自体が参考にならないものだと思いますが… 私のところではライセンスが無くて読めませんが、こちらにストック方法が書かれていませんか？ http://www.springerlink.com/index/u033732447m7t931.pdf

すいません。 削除/引用 No.1371-5 - 2008/06/19 (木) 18:19:30 - Postgrad もっと具体的に書くべきでした。 細胞は平滑筋細胞の初代細胞です。 前任者は一般的な10％DMSO,10％FBS in Smooth muscle cell medium (+Growth suppliment)で懸濁、→液体窒素で凍結していたようです。 凍結時の細胞濃度をあげ、ゆっくりと凍らせることにするとして、保存液の組成をどうするかで迷ってました。 10％DMSOー90％FBSでうまくいくこともあるということなので、試してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.1371-4 - 2008/06/19 (木) 10:01:30 - ~ 何の初代細胞を使っているのかも、前任者の保存法も書けないのでしたら、 あまり参考になる意見が得られるとは考えにくいのですが… その細胞を使っている文献を調べるなり、販売会社に問い合わせてはいかがでしょうか。 90%FBS-10%DMSOで保存する方法はあります。 細胞によっては有効みたいです。 凍結方法についてほとんど書かれていないのですが、 プログラムフリーザーやバイセルは使われていますか？ 強い細胞であれば、キムタオルで撒いて-80℃に放り込むだけでも起きますが、 弱い細胞であれば、それなりに大事に扱ってあげたほうがいいかと思います。 初代繊維芽細胞と初代ケラチノサイトは、 バイセルを使って10%DMSO添加培地で保存できました。

(無題) 削除/引用 No.1371-3 - 2008/06/19 (木) 09:53:59 - -- よっしーさんがおっしゃられてるセルバンカーを僕も使用しています。 たぶんセルバンカーの内容は、FBSに10% DMSOが入ってるものと思います。 つまり9割くらいはFBS。 でもこれは高価なので、通常の保存用の溶液で死んでしまうようなcell lineにしか用いません。 HeLaとかなら10 % DMSO, 10-20 % FBS mediumでいいとは思います。 セルバンカーがないのであれば、FBSを９割くらいにして、DMSO 10%でやってみてください。 それからバイセルという保存のための容器を用いるともっとviabilityはあがると期待出来ます。

(無題) 削除/引用 No.1371-2 - 2008/06/19 (木) 09:45:41 - よっしー 細胞培養する培地そのもので凍結しているのですか？ もしそうでしたら，細胞が起きること自体，不思議なんですが・・・． 通常10%DMSOをその培地に加えたり(FBS濃度をあげることもありますが)， セルバンカーなどの細胞凍結用試薬に懸濁して凍結すると思うのですが・・・．

初代培養細胞の凍結用Medium 削除/引用 No.1371-1 - 2008/06/19 (木) 07:51:08 - Postgrad 初代培養細胞を凍結保存するときの保存液で迷ってます。 同じ細胞を同じ会社から買った前任者によると、この細胞は凍結に弱く、おろしても増殖しなかったりするそうです。（技術的な問題で保存前の状態が悪かった可能性もありますが。）培養液はこの細胞用の特別なもの（10％FBS, Growth suppliment入り）を同会社から購入して使用しています。 調べてみるとDMSOをFBSに溶かすやりかたもあるようですが、普通の10％DMSO,10-20％FBS Mediumと比べて大きく細胞生存率があがるものでしょうか？ その他初代細胞の扱いについてアドバイスありましたらおねがいします。

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