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(無題) 削除/引用 No.1370-7 - 2008/06/20 (金) 21:44:37 - BSA >[Re:6] 名無しさんは書きました : > リコンビナント蛋白質使うのはどうですか。市販のBSAはたいてい牛の血からコーンの方法等で精製したものですから、きれいなシングルバンドになるような純度を期待するのは少し無理があるでしょう。保存過程で不溶物や分解産物を生じることもあるし。リコンビナントなら（別にBSAでなくてもいいですけど）、クマシージェルで見かけ上単一バンドにみせるのはそんなに難しくないでしょう。 アドバイス有難うございます。例えばGSTの様な蛋白質であれば アフィニティーカラムだけでかなりきれいになりますからそれを スタンダードにするのは確かに一案ですね。

(無題) 削除/引用 No.1370-6 - 2008/06/20 (金) 18:23:50 - 名無し リコンビナント蛋白質使うのはどうですか。市販のBSAはたいてい牛の血からコーンの方法等で精製したものですから、きれいなシングルバンドになるような純度を期待するのは少し無理があるでしょう。保存過程で不溶物や分解産物を生じることもあるし。リコンビナントなら（別にBSAでなくてもいいですけど）、クマシージェルで見かけ上単一バンドにみせるのはそんなに難しくないでしょう。

(無題) 削除/引用 No.1370-5 - 2008/06/20 (金) 18:07:29 - BSA APさんレス有難うございます。 > 通常使われるBSAはFraction Vだと思いますが、SDS-PAGEでみると多かれ少なかれサブバンドがでますね。どれくらい多く出るかはブランドやグレードによって違いますが。サブバンドが気になるようだったら、高級品を使うと良いと思います。 いま使っているBSAもFraction Vの様です。サブバンドを完全になくすのは やはり難しいでしょうね。 > 定量のスタンダードとしてはBSAのほかにIgGが使われますが、こっちの方が純度が高く、サブバンドがほとんどでないと思います。還元条件ではH鎖とL差分かれてしまいますが、分子量比が分かっているのでそれぞれのバンドのタンパク量は計算できるでしょう（1レーンで2点とれて便利かも）。 IgGはアフィニティー精製されているでしょうから確かにサブバンド 少ないでしょうね。各社のカタログで一度探してみます。 > もっとも、サブバンドの量は誤差の範囲だと思います。CBB染色ゲルの比色による定量自体、誤差が大きいのでそのなかに吸収されてしまうでしょう。 > CBBの誤差といえば、CBBの染色性はタンパク質によって（アミノ酸組成？）大きく違うといわれていますね。Bradford assayでもBSAとIgGでは検量線の傾きがかなり違います。 CBBは基本的にはペプチド結合と反応するために蛋白質毎のバラつきが 少ないと思っていたのですが、私の勘違いだったのかもしれません。 結局のところどの方法を使ったにせよ絶対的な量を知ることはかなり 難しいということですね。

(無題) 削除/引用 No.1370-4 - 2008/06/19 (木) 21:16:09 - AP 通常使われるBSAはFraction Vだと思いますが、SDS-PAGEでみると多かれ少なかれサブバンドがでますね。どれくらい多く出るかはブランドやグレードによって違いますが。サブバンドが気になるようだったら、高級品を使うと良いと思います。 定量のスタンダードとしてはBSAのほかにIgGが使われますが、こっちの方が純度が高く、サブバンドがほとんどでないと思います。還元条件ではH鎖とL差分かれてしまいますが、分子量比が分かっているのでそれぞれのバンドのタンパク量は計算できるでしょう（1レーンで2点とれて便利かも）。 もっとも、サブバンドの量は誤差の範囲だと思います。CBB染色ゲルの比色による定量自体、誤差が大きいのでそのなかに吸収されてしまうでしょう。 CBBの誤差といえば、CBBの染色性はタンパク質によって（アミノ酸組成？）大きく違うといわれていますね。Bradford assayでもBSAとIgGでは検量線の傾きがかなり違います。

(無題) 削除/引用 No.1370-3 - 2008/06/19 (木) 16:22:43 - BSA おお様 返信いただき有難うございます。 > たしかに、制限酵素に使うBSAをたまに流しますが、マイナーなバンドがでますね。でもそれはあなたがどの程度厳密な定量が必要かなどによって変わってくるのではないでしょうか。マイナーなバンドが5%以下ならメインなバンドでOKとできる実験もあると思いますし、レーン全体をスキャンしてもいいカモしれません。一番重要なのは > 直線性とか再現性ではないでしょうか。わたしはそういう意味でBSAを使ったことはあります。 やはりCBB上での定量は大まかな値で正確な値は期待しないほうがいいか もしれませんね。BSAで何らかの検量線を引いてそれを元に同じゲルに のせた蛋白質の相対量を測るのに使うぐらいですか。 > ゲル上で定量のためにうっている物という観点では思いつきませんが、バイオラッドのプレステインでないサイズマーカーなどは使えるかもしれません、彼らは確かバラ(一つのたんぱく質)でも売っていたと思うのですが、、なければ、サイズマーカーでタンパクの量が記載されているものから一つ選び、スタンダードにしても良いかと思います。 私はこのスタンダード知らないのですがカタログで確認してバイオラッド に問い合わせてみます。

(無題) 削除/引用 No.1370-2 - 2008/06/19 (木) 00:59:01 - おお たしかに、制限酵素に使うBSAをたまに流しますが、マイナーなバンドがでますね。でもそれはあなたがどの程度厳密な定量が必要かなどによって変わってくるのではないでしょうか。マイナーなバンドが5%以下ならメインなバンドでOKとできる実験もあると思いますし、レーン全体をスキャンしてもいいカモしれません。一番重要なのは 直線性とか再現性ではないでしょうか。わたしはそういう意味でBSAを使ったことはあります。 ゲル上で定量のためにうっている物という観点では思いつきませんが、バイオラッドのプレステインでないサイズマーカーなどは使えるかもしれません、彼らは確かバラ(一つのたんぱく質)でも売っていたと思うのですが、、なければ、サイズマーカーでタンパクの量が記載されているものから一つ選び、スタンダードにしても良いかと思います。

CBB染色したSDS-PAGEゲルによる蛋白質定量 削除/引用 No.1370-1 - 2008/06/19 (木) 00:02:34 - BSA いつも参考にさせて頂いています。 私の研究室では基本的にBCA法によって蛋白質サンプルの定量を 行っています。ただ時々サンプル量が少なかったり尿素（変性した 蛋白質の場合）、界面活性剤などBCA法による定量が正確に出来ないと 予想される場合にはCBB染色したSDS-PAGEゲル上でサンプルと標準 蛋白質（現在はSIGMAのBSAを使っています）のバンドの濃さをデンシト グラフによって比べ定量しています。ただ皆さんもご存知かと 思いますが市販のBSAをSDS-PAGEしてCBBで染めると幾つかのマイナー バンドが見られます。SIGMAに問い合わせたところ少なくとも彼らの 標準蛋白質BSAはBrad-ford法などのによる定量を目的として調整されて いるのでCBB上でのバンドの濃さによる定量については保証の限りでは ないそうです。お聞きしたいのは １）皆さんの研究室ではデンシトグラフによる蛋白質定量を行う時 どのような標準蛋白質を使われていますか？ ２）どなたかCBB染色したSDS-PAGE上での蛋白質定量に適した市販の 標準蛋白質をご存知ありませんか？ 何かアドバイスや情報などをお持ちでしたらレスのほど宜しくお願い 致します。

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