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(無題) 削除/引用 No.1369-13 - 2008/06/19 (木) 17:05:34 - L シール付きのビニール袋に、メンブレンと抗体液を入れて、泡を追い出したら、 14x10cmの角シャーレの蓋に乗せ、その上に本体(?)を乗せて、さらに500mlぐらいの液が入る瓶をのせておけば、液中でメンブレンが動いて、よく抗体が結合するような気がします。 瓶 　　　　　　　　↓ |___________________| ←角シャーレの本体 　　　 ------------ ←ビニール袋 |_____________________| 角シャーレの蓋 伝わるといいですが…

(無題) 削除/引用 No.1369-12 - 2008/06/19 (木) 16:42:50 - 中年 うちではバッグにシールした後、２枚のガラス板に挟んでクリップで留めることでバッグのよれを均してインキュベートしています。

100円ショップのビニール 削除/引用 No.1369-11 - 2008/06/19 (木) 15:38:20 - ma5 ハイブリバックがすぐ入手できなければ、よく売っているシールファスナーのついたビニール袋（メンブレンに合わせた大きさの）に泡を追い出し封入してもミニゲルサイズなら２ｍｌでいけますよ。 できれば張りのある素材か上下に平らなものを当てておくとしわ汚れが防げる気がします。

(無題) 削除/引用 No.1369-10 - 2008/06/19 (木) 11:40:23 - window ハイブリバックにメンブレンと抗体液を入れてシールして閉じて、シェーカーで振っておけばいいだけです。 ハイブリバックは主にはサザンのハイブリの時に使用されるので、サザンのプロトコール本などをみれば載っていると思います。

(無題) 削除/引用 No.1369-9 - 2008/06/19 (木) 10:55:25 - あや みなさまありがとうございます。 ハイブリバッグなるものをウエスタンで使ったことがないのですが、 どのように使ったらよいのですか？ そういった説明がしてあるサイトなど、あるいは何かありませんでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1369-8 - 2008/06/19 (木) 10:08:58 - window 二次抗体はshakingできるくらい十分に使っているようなので問題ないと思います。 一時抗体は 他の方もおっしゃっていますが、 個人的な経験で ムラのできやすさは メンブレンの下に抗体液＞メンブレンの上に抗体液＞ハイブリパックに入れる だと思います ハイブリパックのほうが多少抗体量が多くなりますが、失敗して同じ実験を繰り返すことになるのであれば、もったいなくないです。

(無題) 削除/引用 No.1369-7 - 2008/06/19 (木) 00:38:38 - おお >1次抗体は約2mlの抗体希釈溶液をガラス盤上にひろげ、 これ、意外とむらの原因になることがあります。 まず、なにか容器のなかで抗体希釈液をメンブレンの上に垂らし、よく降りながらまんべんに行き届くようにして、更にもう一度容器から抗体希釈液を回収し、メンブレンの上に垂らすという工合に何回か繰り返し、その上にOHPフィルムを適度な大きさに切ったものをカバーしたりすることはあります。それでもむらになることは幾らかあります。10-20分おきぐらいでOHPフィルムを持ち上げてもう一度均一になるように振ってまたインキュベーションと言うのもありかもしれません。 ラップでやると、ラップのしわが写ることもありますし、おそらく、その手のむらだと思います。うまくコントロールするこつをつかめばいいかと思います。

(無題) 削除/引用 No.1369-6 - 2008/06/19 (木) 00:16:40 - AP 可視化はX線フィルムですか、 そうだとしたら、現像は自動現像機、手作業？ 手作業でやる場合、フィルムを現像液に入れたとき、フィルムの下に空気をトラップしてその部分だけ現像の進みが悪くなることがあります。 複数枚のreplicateをとって、ムラのパターンが一定なら、これは当たらないですが。 >1次抗体は約2mlの抗体希釈溶液をガラス盤上にひろげ、 部分的にメンブレンとガラス板がぴったり密着してしまうと、そこだけ抗体のあたりが悪くなることはありそうです（ガラス板だとメニスカスを作りにくくてべちゃっと広がったり、吸着性が強そうな気がする）。それと、メンブレンの上面からの蒸発ムラがないとも限らなさそうです（乾きやすいところはよけいに抗体液を吸いそうな気がする）。やっぱり私は、シールバッグが安心だなあ。

(無題) 削除/引用 No.1369-5 - 2008/06/18 (水) 23:26:19 - あや window さん＞ ありがとうございます。1次抗体は約2mlの抗体希釈溶液をガラス盤上にひろげ、その上にmembraneを、blottinng面が下になるように置いてます。2次抗体は約30mlの抗体希釈溶液をタッパーにいれ、その中でshakingしています。 やはり、１次抗体のときが問題なのでしょうか・・・

(無題) 削除/引用 No.1369-4 - 2008/06/18 (水) 23:22:28 - あや メタノールですか？エタノール消毒液は吹きかけて、拭いていることは、ありますが・・・・

(無題) 削除/引用 No.1369-3 - 2008/06/18 (水) 23:21:06 - window 抗体がメンブレンに均一にあたっていない可能性が高いと思います。 どういう方法で行っているのかわかりませんが、均一に抗体があたるようにハイブリバックに入れるなり、それなりの方法をすればよいです。

(無題) 削除/引用 No.1369-2 - 2008/06/18 (水) 23:15:14 - 通りすがり ECLはメタノールを強烈に嫌います。 二次抗体を洗った後、ピンセットをメタノールで洗って膜を扱ってませんか？ メタノールは危険です。以上。

Westernで染まりにむらがでてしまう！！？ 削除/引用 No.1369-1 - 2008/06/18 (水) 23:09:32 - あや Western初心者なのですが、 ECL kitで反応させて現像しているのですが、いつも、一様にそまらず、毎回一部分がそまらず抜けてしまいます。 strippinngを行って再度１次抗体から反応させても、今度は別の部分がぬけてしまいます。 このようなことがおこる原因は何か考えられませんでしょうか？ 抗体を反応させるたびに、「むらの模様」が異なるで、blottinng以後の問題と考えています。 ちなみに、ECL反応液の時点からやり直しても同じ、むらになるので、1次抗体から2次抗体の反応の間に、何か問題があるのでは、と思っているのですが。 是非どなたか教えてください！！！

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