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(無題) 削除/引用 No.1366-5 - 2008/06/29 (日) 13:23:15 - AP >皆さんはハイブリ後のRNase処理はしていますか？ RNAプローブはバックグランドが高くなりやすいということで、昔はしていましたが、あんまり劇的な効果は得られなかったような気がします。 今、少なくとも私のフィールドの人たちの間では、RNAプローブのISHで高S/Nを得るために、ハイブリバッファーを塩酸で酸性（pH 5.0）に調整して、55-65℃（あるいは70℃くらいまで）の高温でハイブリするのが主流になっていると思います。

追加で質問です。 削除/引用 No.1366-4 - 2008/06/24 (火) 09:20:08 - ks 追加で質問ですが。 皆さんはハイブリ後のRNase処理はしていますか？

(無題) 削除/引用 No.1366-3 - 2008/06/19 (木) 08:12:46 - ks APさん、ありがとうございます。 プローブは、DIGラベルしたRNAプローブを使ってます。私のラボでは、1kb以上のものはアルカリ加水分解で断片化処理していましたが、一度試したいと思います。 あと、プローブ濃度も希釈してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1366-2 - 2008/06/18 (水) 23:39:57 - AP >長さは0.6kbです。 ラベルの方法は？　その長さだと、RNAプローブやPCRでラベルしたものだと断片化処理をしたほうがいいですが、やっていますか。 全体が染まる原因の一つは、プローブが長すぎて、浸透せずに表面に吸着してしまう、あるいは一旦浸透してしまうと洗浄してもフリーのプローブが落ちにくいということがあります。 単純にプローブ濃度が高すぎるという場合も多いです。至適プローブ濃度は、出来たプローブごとに違います。初めて使うプローブは（あるいはいつの濃度で一度やってみて、そういう問題があったときは）5〜10倍くらいの希釈列にしてハイブリをためしてみると良いです。 最後に、同じRNAをターゲットにしても、プローブ配列の選び方によっては。どうしてもうまくいかないこともあります。プローブ配列をずらすとか、トリミングするとかでよくなるかもしれません。

WISHで困ってます。 削除/引用 No.1366-1 - 2008/06/18 (水) 19:56:55 - ks お世話になります。 マウス胚でWISH(whole mount in situ hybridization)をしましたら、10分も経たないうちに、胚全体が染まりました。調べたい遺伝子の発現は既に報告されており、胚全体で発現しているものではありません。プローブは事情により報告とは違う領域を自分でクローニングしたもので、長さは0.6kbです。 原因がわからず、困っています。別のプローブだとうまくいくのですが・・・

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