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(無題) 削除/引用 No.1361-8 - 2008/06/19 (木) 15:45:41 - プラスミド ~さん、 ありがとうございます。大量にノックダウンコンストラクとをしていて、エレクトロポレーションは面倒なので、stbl2と3の両方を試しに使ってみます。 染太郎さん、 プラスミドの数がかなり多いため、ライゲーション／トランスフォーメーション後シングルコロニーを拾ってミニプレップした後はシングルコロニーにしてませんでした。プラスミド液をトランスフォーメーションしてそのまま大量培養してマキシプレップしたのですが、培養を続けていくと本来のバンドが減って、短い３kbくらいのバンドが増えていくのでくみかえなのかと思った訳です。手抜きの恥ずかしい話ですが、はじめてのトラブルで少し良い勉強になりました。 ただ、おっしゃる通り5'と3'のLTRがくみ変わっても3kより長くなるはずなので、そこがわかりません。分解かもしれませんので、stblを試してみて、もう一度考えてみます。 Tnさん ありがとうございます。カタログの指示に従ってstbleコンピテンとセルを使ってみます。

(無題) 削除/引用 No.1361-7 - 2008/06/19 (木) 09:01:23 - Tn こちらの資料に質問者様の知りたい情報が載っているかと思います。 >http://www.invitrogen.co.jp/products/pdf/compcellgd-j.pdf 以前に質問者様と同じような状況に陥った時は、大腸菌を30℃で培養することで対処することができました。

(無題) 削除/引用 No.1361-6 - 2008/06/19 (木) 00:00:17 - 染太郎 ゲル上で15ｋｂ以外に3-5ｋｂのバンドがみられるということでしょうか． 私も似たような経験をして，最初はリコンビネーションが起こったと信じていましたが，いろいろ調べた結果，余計なバンドはcell lysisのときにdenatureしてしまったプラスミドだということがわかり，lysis bufferのNaOHを0.2Mから0.1Mに落とし，手短にlysisすることで解決しました．私の場合Clontechのレンチウィルスで初めてこれを経験したので，レンチにはなにか構造的な弱さがあるのかと考えている次第です． 15kbと3-5ｋｂではdenatureにしては離れすぎているのかもしれませんが，ご一考ください．

(無題) 削除/引用 No.1361-5 - 2008/06/18 (水) 18:41:49 - ~ レトロウイルスベクターとレンチウイルスベクターについて、 Stbl2,3とSureを使ったことがありますが、 どれも組換えはおきなかったので、違いは分かりません。 Sureの方が入りにくいが、収量が少しよかったため、 stblでクローニングした後にsureに入れなおしていた時期もありました。

(無題) 削除/引用 No.1361-4 - 2008/06/18 (水) 18:27:44 - プラスミド ありがとうございます。コンピテントセルを変えてみます。 LTRベクターにはstblの方がsureより良いと思って良いですか？ ストックルームにはstbl2だけがあったのですが、stble2,3,4はトランスフォーメーション効率が違うだけど、組み替えの確率等は変わらないと思って良いでしょうか？

大腸菌 削除/引用 No.1361-3 - 2008/06/18 (水) 15:38:19 - うっちー 以前15kbのベクターにインサートが入らないという件で投稿した事がありました。私もプラスミドさんと同様な現象で随分困っていました。 その後より大きなサイズのインサートを入れなくてはならなくなり、悪戦苦闘しましたが ~さんが書かれているようにStbl4の大腸菌を用いることで何とか欲しいクローンを得ることができました。 それから以前投稿した際に指摘されましたがベクターの切り出しにはUVをなるべく当てないようにするよう気をつけました。 おそらく大腸菌内で組み換えが起こっているものと思われます。

(無題) 削除/引用 No.1361-2 - 2008/06/18 (水) 15:06:26 - ~ >レトロウイルスプラスミド >XL10とXL1-blue レトロウイルスベクター用の大腸菌を使っていないのが原因では？ SuReとかStbl2,3,4などを使ってみてはいかがでしょうか。

プラスミドの分解、安定性 削除/引用 No.1361-1 - 2008/06/18 (水) 15:02:11 - プラスミド サイズが15kbほどのベクター（レトロウイルスプラスミド）を使っているのですが、分解か組み換えがひどくて困っています。 発現コンストラクトを作ったあと、シングルコロニーを拾っても3-5kbくらいの余計なバンドが頻繁に出ます。どこかでコンタミしている可能性もあるので今確認していますが、このプラスミドは分解、もしくは組み換わりやすいのかと思い始めています。 pUCベースに、LTR、パッケージング配列、Epsin-Barr EBNA-1とOriPシスエレメントが入った手作りベクターで、大腸菌はXL10とXL1-blueを使ってます。 分解、組み替えだった場合、培養やプラスミドプレップで注意する点があったら教えてください。

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