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(無題) 削除/引用 No.1359-6 - 2008/11/17 (月) 03:46:15 - おお http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/6342675?ordinalpos=1&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_Discovery_RA&linkpos=4&log$=relatedreviews&logdbfrom=pubmed FIG2あたりが参考になると思います。

(無題) 削除/引用 No.1359-5 - 2008/11/16 (日) 19:09:07 - 追加質問させてください。 おお様がおっしゃられています、「許容範囲かなとも思います。感覚的にですが。詳しくはTRITONの量と細胞由来の脂質の量を大まかに計算すれば良いかと思います。」 この際の許容範囲という根拠になる脂質量とTritonとの量を測定する話について引き続き教えていただけますか？ 具体的にどのように計算してそれを元にどのように判断をされるのでしょうか？ 私自身も界面活性剤についての扱いについて自信がありませんので、トピックを検索していたらここにたどり着きました。 どうか教えていただけないでしょうか？宜しくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.1359-4 - 2008/06/18 (水) 13:55:36 - りょう 私もその濃度ならギリギリ許容範囲だと思います。 Co-IPされるバンドがしっかり出ているなら、buffer量を2-3倍多くして安心のためにやっておいても良いでしょうが、negative controlとしてアバンダントな膜蛋白でリプローブして、そいつは共沈されていないというdataを持っておくのも良いでしょう。 膜上での複合体ということですが、細胞外ドメイン同士あるいは細胞内ドメイン同士（たまに膜貫通ドメイン同士での相互作用を言う人もいますが）の相互作用なのかといったリコンビナント蛋白によるドメイン決定などで相補的に信憑性を高めていくと良いかも。

(無題) 削除/引用 No.1359-3 - 2008/06/18 (水) 13:49:43 - MP 細胞数とlysis bufferの量は適切な範囲と思います（私も感覚的にですが）。 ただ1% Triton, 4度の条件だと細胞膜のいわゆるlipid raftのfractionは溶けてはいないはずです。 IP前の遠心で落としきれていれば問題ないとは思います。 おおさんの書かれているように、何かネガコンを考えるのがいいかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.1359-2 - 2008/06/18 (水) 12:52:16 - おお >僕は１％ Triton X-100を適切なbufferに溶かし、細胞を壊しています。 >通常HeLaを5x10E5くらいを500 ulで溶かしていますが、共沈降を見る時には>5x10E6を500 ulで溶かします。 許容範囲かなとも思います。感覚的にですが。詳しくはTRITONの量と細胞由来の脂質の量を大まかに計算すれば良いかと思います。でIPの洗いでまたデタージェントを使うわけですから、膜フラグメント(細胞膜由来の脂質によるみせる)も洗いでカヨウ化されていくと思えます。 一つは細胞膜にある違うタンパクでネガコンになるものがないか考えることです。 あとクロスリンクなどのアプローチを使ったりして違う観点からもサポートできるデーターを集めるのがいいかと思います。デタージェントで完全にカヨウ化しても、同じデタージェントのミセルに中に共存しているのではという疑問が出てくる可能性もありますよ。

界面活性剤の限界 削除/引用 No.1359-1 - 2008/06/18 (水) 11:58:36 - 学部三年 現在学部三年ですが、研究室にお邪魔して一足先に実験をさせていただいております。 界面活性剤について質問したいです。どうか宜しくお願いします。 現在、内在性同士のタンパクの免疫共沈降の実験を行っています。 仮説ではこの２分子は細胞膜上で複合体を作っていてほしいです。 そこでHeLa細胞を壊してcoIPするのですが、うまく一緒に落ちてくれるときもあれば、 上手く行かないときもあります。抗体はよく使われてるものを使っていますし、normal IgGでは落ちません。 ただ、細胞数をかなり上げて、いつも通りの量の界面活性剤で溶解します。 ここで疑問が生じました。 細胞数を（10倍くらいあげてます。）あげて、共沈降できたといって、そのbandは本当に膜上で複合体を作っているのかなという疑問です。細胞数が多すぎるので、うまく膜が可溶化でいていないんじゃないかと思います。ですが先輩や教授はbandが出たのを喜んでくれます。僕の疑問を質問しても、いい結果がでたからいいじゃんと言われてしまいました。 物質化学の授業で界面活性剤のCMCを習いました。 界面活性剤の各能力には限界があることも習いました。 そこで自分なりに各界面活性剤のCMCをcurrent protocol of molecular biologyで調べたのですが、実際に、この界面活性剤でどのくらいの細胞数までしっかり可溶化できます。とは書かれてありませんでした。もちろん細胞にも色々大きさがあるので、一概にこの細胞数まで！！とは書かれていないとは思いますが。 みなさんは、界面活性剤で壊せる細胞数をどうやって 知りますか？ぜひ教えて下さい、お願いします。 僕は１％ Triton X-100を適切なbufferに溶かし、細胞を壊しています。 通常HeLaを5x10E5くらいを500 ulで溶かしていますが、共沈降を見る時には5x10E6を500 ulで溶かします。かなり共沈降のdataはうさん臭いと思いますよね。 もちろん膜タンパク同士なので、細胞質のタンパク（たとえばアクチンとか）でIP産物をIBすれば、ちゃんと可溶化されてるかはわかりますが、、実際、アクチンでました。ですが先輩も気にするなと。。 ですので、一般的に細胞数はこれまでしか溶かせない！とう参考値は各界面活性剤ごとにきめられてるのでしょうか？ というより界面活性剤の各パラメータの読み方も正直よくわかりません。 どなたか教えてくれませんか、宜しくお願いします。

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