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(無題) 削除/引用 No.1354-8 - 2008/06/19 (木) 03:50:23 - GP 親切なご説明ありがとうございました。 よく理解できました。 今後ともよろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.1354-7 - 2008/06/19 (木) 03:41:49 - おお > > おおさんへ > 基本的な事でもうしわけありませんが、 > もう少し質問させてください。 > ＞基本的に検量線はあなたのサンプルのターゲットの量をカバーしてなくて　は定量という意味ではデーターになりません > もし目的とするサンプルのデータが検量線の1倍の値より大きい（Ｃｔ値としては小さい）場合はデータにならないということでしょうか。 データーにならないかどうかはどの程度の定量を考えているのかなどにも依存します。敢えて厳しくいった次第で、一応大抵のバイオケミカルな測定は検出の上限と下限があると言う事を認識してもらいたいと思ったからです。検量線でみてもない範囲に関して直線性があるとか検出の上限を超えてないと言切れるかどうかというのが私の意図です。RTPCRですから、たいていのプロトコールでは上限は超えないような気もしますし楽観的にはまあ大丈夫だろうと思いますが、、、、あと検量線で取った値より多い場合は、薄めて取直すこともできます。 絶対的な物が欲しいなら、T7RNAポリメラーぜなどでRNAを作っておけばいいかとも思います(ポリA配列をつける必要がありますが)。マイクログラム単位で合成できますので、1回合成すれば事足りるとおもいますよ。

(無題) 削除/引用 No.1354-6 - 2008/06/19 (木) 01:59:05 - う〜んと 定量PCRに限らず一般的に検量線の直線性が保証できるのは、測定点の内側だけですね。 発現量の一番多い試料を使えと教科書にあるのは、測定点より外れた数値は検量できないからです。 マウスやヒトの遺伝子についてならば大抵の遺伝子はGEO等で高発現の組織がわかりますから、組織の大きさ等も考慮して使いやすい別固体のRNA試料を検量線作成に使えばいいと思います。 定量PCRの場合、測定系自体のダイナミックレンジは１０＾７レベルですが、実際の測定で１０＾７コピーも発現している遺伝子は多くないでしょうね。 なので、通常問題になるのは検量線の下限値ですね。 鋳型をどんどん希釈していくとCt値が直線に乗らない濃度が現れます。 それが信頼限界で、理論上は絶対コピー数が1以下の場合に現れます。 �刧僂t法で相対定量する場合には絶対コピー数を出せないので見落とされるかもしませんが、検量線の下限値となるCtを下回って測定されたデータは棄却されるべきです。それに、当たり前ですが、こういう数値は再現が悪いです。 上限値を超えてしまった場合は、測定試料を希釈して検量線の範囲内に収めなければいいです。 ご参考まで

もう少し質問させてください。 削除/引用 No.1354-5 - 2008/06/18 (水) 22:29:26 - GP 早速のご返事ありがとうございます。 皆様のおっしゃるとおり1倍から10の６乗倍まで10倍希釈で行っております。 おおさんへ 基本的な事でもうしわけありませんが、 もう少し質問させてください。 ＞基本的に検量線はあなたのサンプルのターゲットの量をカバーしてなくて　は定量という意味ではデーターになりません もし目的とするサンプルのデータが検量線の1倍の値より大きい（Ｃｔ値としては小さい）場合はデータにならないということでしょうか。 直線性が得られればそれに載せてデータを出してもかまわないと思っていました。 だとすると目的とするサンプルより過剰に発現しているサンプルを検量線に用いなければならないということでしょうか。 （確かにサンプルのなかで一番発現量の多いものを使えと書いてある本もありますが、実験の都合上、実サンプルの消費をおさえたいものですから別の固体の同じ組織から検量線用にｃＤＮＡを作っていました） OOPufさんへ 確かにおっしゃるとおりかもしれません。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.1354-4 - 2008/06/18 (水) 04:44:36 - OOPuf 検量線をそんなに薄くする必要があるのでしょうか？ サンプルについてターゲットの発現量が低いのであれば、 10倍希釈の希釈系列ではなく、2倍希釈などの希釈率が低い系列を検討されたほうがよいのではないでしょうか? それだと6段階の希釈系列も作れるはずです。

(無題) 削除/引用 No.1354-2 - 2008/06/18 (水) 04:07:58 - おお 基本的に検量線はあなたのサンプルのターゲットの量をカバーしてなくては定量という意味ではデーターになりません。希釈した状態で、スペシフィックなRNAが増幅する前に、或いは同時に非特異な物が出てくる段階で、その濃度は検出限界と考えて良いと思います、或いはその希釈でPCRの時の反応系にターゲットが1コピー以下の割合でしか存在しないかもしれません。この場合はプライマーを変えても改善しないでしょうね。 >またそうなると3-4点しかとれないことになり検量線の信頼性が低下する　 3-4点の濃度の範囲内で信用できるといえます。質問の様子から10×希釈で検量線をとっていると思われますから1000-10000の濃度のレンジで信用ができるデーターが取れるというと言う事ではないでしょうか。このレンジがあなたの実験において十分かどうかはあなたの実験によると思います。例えばマイクロアレーのダイナミックレンジでは10000は取れないと思います。

リアルタイムPCRの検量線について 削除/引用 No.1354-1 - 2008/06/18 (水) 02:27:09 - GP はじめまして。 Real time RT-PCRを最近始めた者です。 この掲示板ではいつも勉強させていただいております。 現在動物の平滑筋組織よりtotal RNAを抽出しOligo-dtを用いてcDNAを作製しＲＴ−ＰＣＲをしております。検量線を作成する際、サンプルと同じ組織より同じ方法で作製したcDNAを６段階希釈して40cycle回しております。しかしプライマーによっては5-6段階目くらいの非常に薄い濃度ではdetectできなかったり、また detect できても非特異的反応（or primer dimmer?）が増加し直線性が失われたりします。 そこで質問があります 1　実際測定するサンプルのＣｔ値は1倍希釈と同程度のものなので 　10000-100000倍といった薄い濃度での 非特異的反応を無視してはいけない　のでしょうか。 2　またそうなると3-4点しかとれないことになり検量線の信頼性が低下する　とおもわれますが、目的とするｍＲＮＡがもっと高発現している別の組織　を検量線用に用いてもかまわないのでしょうか。（つまりたとえば脳のサ　ンプルで作製した検量線を平滑筋のサンプルに用いるといったような） 　 プライマーを設計し直すのがベストなのでしょうが、 周りに詳しい人がおらず、さじ加減のようなものがわからず質問させてい　ただきました。 よろしくお願いいたします。

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