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トランスフェクション細胞の染色 トピック削除
No.1353-TOPIC - 2008/06/17 (火) 22:36:22 - t
現在ＰＣ１２細胞にFLAG-Tagつきのタンパク質を発現させ、形態の変化を見ようと思っています。

そこで方法として、FLAG-Tagつきのタンパク質を持つベクターとベータガラクトシダーゼを持つベクターを１０：１でトランスフェクションし、染色後に染まった細胞の形態を見ようと思っています。

しかし、これでは直接的でないので、FLAG-Tagつきのタンパク質を持つベクターが入った細胞を染色しようと思っています。FLAG-Tagに対する免疫染色で見れると思うのですが、蛍光顕微鏡等の蛍光観察機器が自分たちは持っていなくて、他の研究機関まで足を運ばなければなりません。

そこでお聞きしたいのですが、FLAG-Tagに対して蛍光ではなくベータガラクトシダーゼの様な色の変化で見れるような方法どなたかご存じないでしょうか？
　
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(無題) 削除/引用
No.1353-9 - 2008/06/18 (水) 22:49:03 - t
皆様、

貴重なご意見ありがとうございました。
最後に厚かましい質問で申し訳ないのですが、どなたか細胞レベルでこれらの染色を行った論文、または使ってよかった染色キットをご存じないでしょうか？

(無題) 削除/引用
No.1353-8 - 2008/06/18 (水) 14:06:04 - MK
回答になっていないかも知れませんが、βガラクトシダーゼを発現する細胞で確実に目的のタンパク質が発現しているようにしたいのであればIRESで目的のタンパク質とβガラクトシダーゼをつないで一つのベクターから発現させるということもありかなと思います。

(無題) 削除/引用
No.1353-7 - 2008/06/18 (水) 06:07:04 - sea
リンクを貼り忘れました。

Vector Labs
http://www.vectorlabs.com/products.asp?catID=392&locID=609342

(無題) 削除/引用
No.1353-6 - 2008/06/18 (水) 01:52:23 - sea
可視光でシグナルを見たい、ということになると思うのですが、
一般に
(1) 酵素
(2) その酵素で呈色するsubstrate

の組み合わせで考えます。
(1) としてalkaline phosphatase, peroxidase(HRP を含む)、
(2) としてそれぞれに対応する発色基質がある、という感じです。
DABはもっとも代表的な基質で、茶色を呈しますが、
金属を加えることで色を変えることも出来ます。

発色基質に関してはVectorから色々出ていますので
下記サイトからチェックしてみてください。

選択のポイントとしては、組織の免染では
(a) どの色で見たいか
(b) 色素がキシレンで溶けるか
(c) permanent mountにしたいか
(d) 見たい組織・細胞に内因性のperoxidase 活性、
ALP活性がないかどうか

になることが多いのですが、一時的な染色でいいのであれば
(a), (d)だけでもいいような気がします。
まあ内因性の酵素活性もブロッキングとかすればいいので
対処可能ですが。

ちなみにALPを使った場合、多くのsubstrateはキシレンで
消えてしまいますが、キシレン耐性の色素も別の会社から
出ていたりします。
細胞で染めるのでたぶんグリセロールとかそれに類した
mountになると思うのであまり心配する必要はないと思いますが。

(無題) 削除/引用
No.1353-5 - 2008/06/17 (火) 23:00:10 - t
window様

お返事ありがとうございます。DAB染色は茶色に染まるのですね。

アルカリフォスファターゼとＤＡＢ染色ではメリット、デメリット等あるのでしょうか？
どなたかご存知でしょうか？

(無題) 削除/引用
No.1353-4 - 2008/06/17 (火) 22:55:10 - window
DAB発色でも茶色く染まるように発色できます。
蛍光に比べて感度は良くないですが、過剰発現タンパクなら問題ないでしょう。

(無題) 削除/引用
No.1353-3 - 2008/06/17 (火) 22:54:09 - t
通りすがり様

早速のアドバイスありがとうございます。
アルカリフォスファターゼということですが、どういった感じに染色されるのでしょうか？もし可能でしたら、参考になる論文やサイトを教えていただけないでしょうか？

(無題) 削除/引用
No.1353-2 - 2008/06/17 (火) 22:47:46 - 通りすがり
アルカリフォスファターゼをお使いください。

トランスフェクション細胞の染色 削除/引用
No.1353-1 - 2008/06/17 (火) 22:36:22 - t
現在ＰＣ１２細胞にFLAG-Tagつきのタンパク質を発現させ、形態の変化を見ようと思っています。

そこで方法として、FLAG-Tagつきのタンパク質を持つベクターとベータガラクトシダーゼを持つベクターを１０：１でトランスフェクションし、染色後に染まった細胞の形態を見ようと思っています。

しかし、これでは直接的でないので、FLAG-Tagつきのタンパク質を持つベクターが入った細胞を染色しようと思っています。FLAG-Tagに対する免疫染色で見れると思うのですが、蛍光顕微鏡等の蛍光観察機器が自分たちは持っていなくて、他の研究機関まで足を運ばなければなりません。

そこでお聞きしたいのですが、FLAG-Tagに対して蛍光ではなくベータガラクトシダーゼの様な色の変化で見れるような方法どなたかご存じないでしょうか？
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