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(無題) 削除/引用 No.1341-8 - 2008/06/18 (水) 23:13:59 - AP >[Re:7] はなさんは書きました : > 真核生物ではそうなのかもしれませんが、原核生物では時間は多少かかりますが、染色できます。 へー、そうなんですか。知りませんでした。 > 原理的には、DNAの合成が行われていれば、原核生物だろうが、真核生物であろうがBrdUは使えますよね？ 原核生物でやっている文献はあるので、使えると思います。 BrdU（5-bromo-deoxy-uridine)や抗BrdU抗体は、Sigma, Merc（Calbiochem）、GE (Amersham)、Rocheなどから出ています。

(無題) 削除/引用 No.1341-7 - 2008/06/18 (水) 21:13:06 - はな > DAPIやYOPROはintactな細胞は染まらないんではなかったですか？死んだ細胞ややApoptoticな細胞じゃなければ、、もしそういう細胞をターゲットしているなら、BrdUは代替になりませんね。 真核生物ではそうなのかもしれませんが、原核生物では時間は多少かかりますが、染色できます。 私が対象にしているのは、intactな原核生物です。原理的には、DNAの合成が行われていれば、原核生物だろうが、真核生物であろうがBrdUは使えますよね？

(無題) 削除/引用 No.1341-6 - 2008/06/18 (水) 16:38:20 - AP >>ARさん >染色剤は、DAPIとYOPROを使っていました。 >BrdU初めて知りました。とても魅力的な方法なので、検討してみたいと思います。もしAPさんが使用されているのでしたら教えて頂きたいのですが、この蛍光は、例えばOlympus BX51などの普通の蛍光顕微鏡でも確認できるほどの蛍光強度でしょうか？（もちろんDNAの量に比例するかとは思いますが。。。） BrdU自体は蛍光色素ではなく、DNAをハプテン化するだけです。抗BrdU抗体で検出しますが、好みの標識二次抗体をを使えばお好みの波長で観察できます（たとえば(FITC)。強度はBrdUをどれだけ取り込ませたかによると思いますが、一般的に、他の抗体染色などと比べるとかなり強いです。 DAPIやYOPROはintactな細胞は染まらないんではなかったですか？死んだ細胞ややApoptoticな細胞じゃなければ、、もしそういう細胞をターゲットしているなら、BrdUは代替になりませんね。

(無題) 削除/引用 No.1341-5 - 2008/06/18 (水) 10:52:13 - はな APさんおおさんありがとうございました。 >ARさん 染色剤は、DAPIとYOPROを使っていました。 BrdU初めて知りました。とても魅力的な方法なので、検討してみたいと思います。もしAPさんが使用されているのでしたら教えて頂きたいのですが、この蛍光は、例えばOlympus BX51などの普通の蛍光顕微鏡でも確認できるほどの蛍光強度でしょうか？（もちろんDNAの量に比例するかとは思いますが。。。） ＞おおさん ご指摘の通り、遺伝子組み換えによる蛍光タンパク質発現は有効だと思います。既に試しており、こちらでは上手くいきました。 ただ、多種類のサンプルで使いたいと考えており、より簡便でお金のかからない方法を目指しているので、染色法に切り替えたんです。特異的な抗体も、同様の理由で試していません。 凍結は確かに使えるかもしれませんね。他の人で試している人がいないかしらべてみて、今度試してみます！

(無題) 削除/引用 No.1341-4 - 2008/06/16 (月) 21:31:41 - おお 原核生物は、急速に凍結して固定することはできないでしょうか、、、 ヒトの組織とか、凍結し、凍結した状態で切片を作成して 乾燥させて、から免疫染色したりします。 凍結ならいろいろ洗うこともないかと、、、

(無題) 削除/引用 No.1341-3 - 2008/06/16 (月) 21:19:48 - おお どちらか一方に蛍光タンパクを発現させるとかできないですか。 あるいは特異的抗体とか、、、

(無題) 削除/引用 No.1341-2 - 2008/06/16 (月) 18:51:43 - AP 染色剤はなんでしょう。その性質によると思います。 生体染色しているのであまり一般的な染色剤ではないかもしれませんね。 確実かなと思うのは、BrdU存在下でしばらく培養してDNAにとりこませ、 固定後に抗BrdU抗体で検出する方法です。固定前に判別する必要があるなら、今やっている染色と併用すれば良いと思います。

核酸染色後の固定 削除/引用 No.1341-1 - 2008/06/16 (月) 17:11:15 - はな 　ある原核生物を核酸染色後、別の核酸染色剤で染色した別の菌体と混合し、顕微鏡観察をすると、それぞれの菌体を色で区別できました。 　しかし、その後４%ホルムアルデヒド固定、洗浄した所、核酸染色剤が漏れだしてしまい、全て同じ色になりました。多少もとの染色剤の色の方が強いのですが・・・ 　これは、固定している間に核酸染色剤が拡散したということでしょうか？ 　同様の実験を行っている人はいないと思いますが、何か思う所がある人はいらっしゃいますでしょうか？また、他の固定の方法で、拡散染色済みのサンプルを漏れださずに保存できている方はいらっしゃいますでしょうか？ 　実験の手順上、すぐに顕微鏡観察をするだけでなく、染色後に固定をする事が必要なのです。

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