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(無題) 削除/引用 No.1338-20 - 2008/06/28 (土) 10:08:48 - カナマイシン >おお様、AP様 非常に詳しい情報をありがとうございました。 かなり実用的な部分まで教えていただきまして、本当にためになります。 しかし相当に感度が良いのですね。びっくりです。他に応用がききそうですね。 褪色するんですか… >AP様 それこそ、やった方にしかわからない情報ですよね。 気をつけます。鉛筆で早めにマークしつつ、写真を撮っておきます。 感謝です。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1338-19 - 2008/06/27 (金) 17:34:10 - AP >[Re:17] カナマイシンさんは書きました : > そこで、実際のプロトコールについて教えて頂けないでしょうか。 お書きになった方法で良いです。Molecular Cloningでは染色の前に酢酸処理するようになっていますが、やってもやらなくても変わらない感じです。 染色液は使い回しがききます。私はコニカルチューブに作っておいて、その中に切り離したマーカーレーンをジャポッと浸けています。 蒸留水の脱染色は、やりすぎると見えなくなるので、目で見ながらちょうど良いところで止めます。たいていは、短時間、二、三回じゃじゃっとすすぐ程度で大丈夫です。乾燥すると薄くなり（濡らすともどるけれど）、時間がたつと退色することがあるので、すぐに鉛筆でバンドの位置に印を付けておきます。 マーカーの量は多い方がはっきり見やすいですが、１レーン100-200 ng、普段EtBrでみる量くらいでも十分です（lambda HindIIIのような低分子量の重量が少なくなるようなマーカーだと短いバンドが見にくいことはある）。 傷や指紋は経験したことがないですが、わたしはこのようにしています。 トランスファ終了後、ゲルからメンブレンを離すまえに、レーンの位置を鉛筆などで印を付けておきます。固定、SSC洗浄などの処理がすんだら、ラップで包み、その上から定規とカッターをつかってマーカーレーンを切り離します。 ハイブリが非常にうまくいってバックグランドが非常にきれいだとマーカーレーンをフィルムに合わせるとき困りますが、バックが出るくらいのオーバーエクスポージャもしておくとか、フィルムカセットに固定したメンブレンに合わせて、その上から現像済みのフィルムをあてたりすると、位置決めが楽です。

(無題) 削除/引用 No.1338-18 - 2008/06/27 (金) 16:45:29 - おお > > そこで、実際のプロトコールについて教えて頂けないでしょうか。 > > ネットで簡単に調べる限りでは、 > 0.3 Ｍ 酢酸ナトリウムバッファー（pH5.0）で0.02％メチレンブルー溶液を調製 > →ブロット・固定後のメンブレンを５分浸す > →蒸留水で脱色 > という感じだったのですがよろしいでしょうか。 ノーザンで結構その方法で昔からやっている人はいるようですね。染色液につける前に5%酢酸で処理をしていたと思います。DNAでも使えると思います。わたしはT7RNAポリメラーぜのトランスクリプション反応後ポリアクリルアミドで精製する時のRNAの染色でも使ってます。メンブレン上の感度はナノグラムオーダです。トータルな感触ではエチブロより1オーダー劣るか劣らないかと考えていいかと思いますが、メンブレン上での感度は文献の数字を見る限りエチブロに匹敵するぐらいになっていたと思います。ゲルのなかのDNAを染めるのに使ったりすることもできるようですが、この時はかなり感度が悪い感覚はあります。モレキュラークローニングにも載っていたような気がします。 最近、ゲルないのエチブロをつかわないRNA染色ようキットが出回っていますが、多分中身はメチレンブルーではないかと思っています。

(無題) 削除/引用 No.1338-17 - 2008/06/27 (金) 16:07:59 - カナマイシン ちょっと前のトピックに横やりですみません。 AP様のおっしゃるメチレンブルー染色、知りませんでした！　便利ですね！ いつもゲルのエチブロ染色像に定規を当てて写真を撮ってましたが、 写真と実際がずれることがままありまして… というかAP様のおっしゃる方法を使えば、ゲルをエチブロで染める必要すらないですね （もちろんラダーがしっかりできてるかは確認したいところですが）。 そこで、実際のプロトコールについて教えて頂けないでしょうか。 ネットで簡単に調べる限りでは、 0.3 Ｍ 酢酸ナトリウムバッファー（pH5.0）で0.02％メチレンブルー溶液を調製 →ブロット・固定後のメンブレンを５分浸す →蒸留水で脱色 という感じだったのですがよろしいでしょうか。 また、感度はいかほどでしょうか？　 数十 ng でも見える感じでしょうか？　マイクログラム近くの量が必要でしょうか？ それから（もちろん汚さないにこしたことはないですが）メンブレンのキズや指紋には センシティブでしょうか？　それとも鈍感でしょうか？ どなたかご教授いただければ幸いです。

(無題) 削除/引用 No.1338-16 - 2008/06/17 (火) 11:23:20 - おお > DIG創成期からのユーザーなんですが、 > ええと、DIGで推奨しているのはRocheのナイロンメンブレン、ポジティブチャージなんですが、これはPallのBiodyne plusと同等品ということです（厚さがちょっと違うようですが）。ポジティブチャージならなんでもよい訳ではなく、品質にずいぶん差があったので、ブランドによっては化学発光でバックグラウンドが高くなるということはありました。 そうですか、ロッシュでは最初から推奨してたんですね。私はどちらかというと、キットとか全部ロッシュでという考えはありませんでしたので、DIGも標識UTP買えばあといらないジャンみたいなところがありましたから、いろんな情報がまぜこぜになっていた様です。 > また、ノンチャージのナイロンメンブレンはアルカリトランスファにむかないですが（核酸が吸着しにくい）、NaOHに加え、NaClを添加することでアルカリトランスファで効率の良いブロッティングができるということは当時から知られていました "NaOHに加え、NaClを添加" これは出来るだろうなと推測していたのですが、そういうプロトコールがあるのですね。Pall(Biodyne)やロッシュのメンブレンは使わないので、情報が偏っていたかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1338-15 - 2008/06/16 (月) 23:28:00 - AP > > >(アルカリトランスファーはこの手の検出系にはよくないと聞きますので、中和が必要です) > > > > これは根拠が思い浮かびません。DIG推奨のプロトコールでもアルカリトランスファです。 > > 昔はそうでなかったとおもいます。 > サポートする理屈については分かりませんが、アルカリのDigへの影響かもしれませんね。あと、アルカリトランスファーはポジティブチャージメンブレンを使うのもあって、化学発光のバックグランドを気にすることもあったようです。ブロッキングなどの工夫も施されてきているのではとも思えますね。 DIG創成期からのユーザーなんですが、 ええと、DIGで推奨しているのはRocheのナイロンメンブレン、ポジティブチャージなんですが、これはPallのBiodyne plusと同等品ということです（厚さがちょっと違うようですが）。ポジティブチャージならなんでもよい訳ではなく、品質にずいぶん差があったので、ブランドによっては化学発光でバックグラウンドが高くなるということはありました。 また、ノンチャージのナイロンメンブレンはアルカリトランスファにむかないですが（核酸が吸着しにくい）、NaOHに加え、NaClを添加することでアルカリトランスファで効率の良いブロッティングができるということは当時から知られていました（このへんの資料はPallが公開していると思います）ので、ナイロンメンブレンの時代になってからはSSCのトランスファはup-to-dateではなかったです。 ブロッキングは溶解バッファーの組成のマイナーチェンジはあったものの、基本的に1% Blocking Reagent (カゼイン由来）で変わっていません。

(無題) 削除/引用 No.1338-13 - 2008/06/16 (月) 23:02:14 - おお >[Re:12] APさんは書きました : > >サザンでフォルムアミドはあまり好んで使われません。DNAーDNAのハイブリにはあまりよくないようです。 > > formamideはハイブリのkineticsを下げる（プラトーに達する速度が遅くなる）といわれています。しかし、O/Nのハイブリならほとんど差はないです。 DNA-DNAのハイブリでMismatchがある場合もあまりよくなかったのではないかと記憶してます。異種の生物のプローブを使う場合は要注意です。 > >(アルカリトランスファーはこの手の検出系にはよくないと聞きますので、中和が必要です) > > これは根拠が思い浮かびません。DIG推奨のプロトコールでもアルカリトランスファです。 昔はそうでなかったとおもいます。 サポートする理屈については分かりませんが、アルカリのDigへの影響かもしれませんね。あと、アルカリトランスファーはポジティブチャージメンブレンを使うのもあって、化学発光のバックグランドを気にすることもあったようです。ブロッキングなどの工夫も施されてきているのではとも思えますね。

(無題) 削除/引用 No.1338-12 - 2008/06/16 (月) 22:33:36 - AP >サザンでフォルムアミドはあまり好んで使われません。DNAーDNAのハイブリにはあまりよくないようです。 formamideはハイブリのkineticsを下げる（プラトーに達する速度が遅くなる）といわれています。しかし、O/Nのハイブリならほとんど差はないです。 formamideを使うと、ハイブリ温度を低くできるのでNorthernやRNA probeのときにRNAにたいするダメージ減らせるということはあると思います。また、formamide含有の方がバックグランドが低くなるとか、メンブレンから核酸がはがれにくい（ニトロセルロース膜を使っていたことの話ですが）、ということはいわれています。 >(アルカリトランスファーはこの手の検出系にはよくないと聞きますので、中和が必要です) これは根拠が思い浮かびません。DIG推奨のプロトコールでもアルカリトランスファです。ひとつ考えられるのは、メンブレンからアルカリをよく取り除かないでハイブリに持って行くと、ハイブリ液が強アルカリになってプローブのDIGがはずれてしまうということですが（これは経験済み）。

(無題) 削除/引用 No.1338-11 - 2008/06/16 (月) 11:30:42 - おお >0.3N　HCLで20分間浸透した後に20×SSCを用いてブロッティングしています。 0.3N　HCLは必ずしも必要ではありません。バンドが10kbps以下であれば、この処理がなくても十分トランスファー可能です。ぎゃくに、HClはDNAを断片化しますが、どの程度細かく断片かするかという点でコントロールしにくく、必要以上に短くなっている恐れがあります。しかしながら、メンプレンにDNAを移す前にDNAは1本鎖になってなければいけません。そうしないと、吸着しにくく、したとしてもハイぶりできる状態にはなりません。0.5 NaOH,1M NaClでアルカリにふって、1.5M Tris-HCl pH7などのバッファーでpHをもどして、SSCでトランスファーするのがいいかと思います(アルカリトランスファーはこの手の検出系にはよくないと聞きますので、中和が必要です)。 >マーカーはdig ラベルされたRocheのDNA moloculer weight marker �Uを利用しています。10μl(100ng)流して、バンドははっきり確認できます。 上に書きましたように、サザンの検出感度はpgオーダーの感度が求められます。それとこのマーカーはアルカリで安定でしょうか? くわえて、ラベルの効率も重要です。お使いのキットにおいてどのように評価するのがいいかは分かりませんが、評価する系をもっていたほうがいいです。

(無題) 削除/引用 No.1338-10 - 2008/06/16 (月) 11:29:22 - おお >1、CTAB法で抽出した植物DNA　(800Mbpくらいで6倍体)　ゲノムサイズが大きい >のでかなり多めに30μg流しています。 とりあえずEcoR1で処理 30ugは確かに多いですね。6倍体の中で1コピーだけというのであれば分からなくもないですが、30で検出できて20で検出できないといった微妙なものではないと思いますので、ちょっとだけ少なめにしてみてはと思います。オーバーロードは検出感度をかえって落とします。で幅が広めのコームを使いましょう。人の場合は1倍体で300M、通常2倍体で1ー2コピーを検出するのに5-10ugつかいます。1ugでも検出できることになっているようです(800Mbpくらいで6倍体とかいてますが、6倍体ごうけいで800Mなのかと言う所がはっきりしませんでしたので 直接のアドバイスはできませんでしたが参考に人の場合の数字をしめしました)。あとは大きめの電気えいどうそうでゆっくり流す方がきれいです。どの程度とは言いづらいですが、昔は50cm以上ある電気えいどうそうでオーバーナイトというのもよく聞いたことがあります。5時間とか数時間はかけた方がいいでしょうね。 >2、プローブは100bpほどです。AFLPで検出したバンドを切り出して読んだ配列をもとにしているので、プローブ変更が出来ません。 これはまあ仕方ないですね。100bpsでもヒトゲノムでは十分かと思います。100bpsぐらいの長さのものを3回ぐらい繰り返して(同じ方向が望ましいと思う)300bpsぐらいにしてサブクローニングしプローブを作っている人もいました。本人いわくこちらのほうが感度がいいということでした。 >3、なるべく高ストリンジェンシーで行いたい(非特異的なバンドは出したくない)。今回は65℃ハイブリ、 65℃ハイブリは悪くないですね。フォルムアミドを使っていなければこんなもんでしょう。ハイブリ液はチャーチリンサンバッファーを使った系がいいように思えますが、この辺はプローブの相性みたいな者で変わることがあります。サザンでフォルムアミドはあまり好んで使われません。DNAーDNAのハイブリにはあまりよくないようです。でも使う人もいるとはおもいます。プローブをRNAにする方が感度が上がるのでRNAプローブにしてフォルムアミドを使う人はいます。 >洗浄は0.1×SSC　0.1%SDSのかなりな高ストリンジェンシーで行いました 最終的にこの濃度は悪くないと思います。私は段階的にあらっていきます2xSSC室温、1xSSC室温、0.2xSSC室温、0.1xSSC室温、0.1xSSC 50度ぐらいでしょうか。RIを使っていましたので、シグナルをモニタリングしながらバックが可也落ち、局所的に強いシグナルが得られるなら、その時点でまず検出して見るといったぐあいです。RIをお使いでないので、(0.2xSSC室温)、0.1xSSC室温、0.1xSSC 50度のメンブレンを用意して検出して条件を決めてもいいかもしれません。ノンスペかどうかはそれぞれを比べてみるとだいたい察しがつくと思います。ハイブリ条件がそこそこのストリンジェンシーなので、洗うのはラフでも結構スペシフィックなものがえられます。 >4、digで検出しています。digマーカーは検出出来ています。 ポジコンにあなたのプローブに使うテンプレートのDNAをつかってみてはどうですか?クローニングベクターに入っているなら、リニアライズして(3kbpsぐらいでしょうか)何かキャリアー(サーモンスパームDNA10ugぐらいとか)中に10-50pg程度含まれるようにして流せば実際にプラティカルな量に近いポジコンになります。サーモンスパームをキャリアーでつかうならサーモンスパームだけのネガコンも必要かもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.1338-9 - 2008/06/16 (月) 11:17:41 - AP >>固定の方法は？　 >変性溶液1.5M NaOH 0.5M NaClで15分浸透×2 ブロットしてからメンブレンを処理しているということですか。 そういうtipsがあるのは知っていましたが、やはりゲルの中で変成するほうがスタンダードだし、感度も良いようです。先に書いたようにdepurination後の鎖の切断という意味でも、メンブレンへの吸着のしやすさという意味でも。 十分固定されていないうちに振盪すると、NaOH/NaCl中でもはがれ落ちる可能性もあります。 ナイロンメンブレンにはアルカリ処理で固定できるといわれていますが、bakingやUV処理をしないとかなりはげ落ちます。私はbakingの場合、加水分解が心配なので、メンブレンに20xSSCなどを浸透させて、アルカリ溶液を置換してからやっています。 どちらにしろ、ハイブリの前に良くアルカリ溶液を除いておかないと、DIGがはずれてプローブの感度が悪くなります。

(無題) 削除/引用 No.1338-8 - 2008/06/16 (月) 10:45:57 - AP >すみません。プローブの能力を評価する方法があるということでしょうか？勉強不足でして、こういったことを試してみたことがありません。 これ非常に重要です。ハイブリの成否はプローブの出来にかかっているとっても過言ではなく、ここを押さえてからでないと、やっても無駄になってしまうことになりかねないです。 説明書にもやり方が書いてありますし、たしかラベル済みの比較用コントロールもついてきているのでは。ナイロンメンブレンに希釈列をブロットして検出して評価します。Rocheではチェック用のストリップ（尿検査のストリップみたいのにコントロールの希釈列がブロットしてあるものと、自作プローブの希釈列をブロットするためのもの）も別売りしています。 >・プローブはroche社のpcr dig probe synthesis kitを用いてPCRで作製しています。 PCRの場合は電気泳動もしてちゃんと完全長が出来ているかみておいた方がいいですね。DIG-dUTPがはいるとPCRは伸びにくくなるので、場合によってはラベルなしのdNTPで薄める必要があります（そうすると比活性が下がるので兼ね合いを考える必要があります）。 ・0.3N　HCLで20分間浸透した後に20×SSCを用いてブロッティングしています。 Alkali denatureはしていないのですか。これをやらなければDNAは二本鎖のままでプローブはハイブリしません。また、せっかくdepurinationしてもNaOHで処理しないと鎖は切断されません（骨格からプリンがはずれるだけ）。 トランスファはSSCでやるよりNaOH (& NaCl）でやった方がだんぜん良い結果が得られます。ただし、DIGラベルのマーカはDIGのリンカーが切れてはずれてしまうので使えません。ラベルなしのマーカーを使い、メンブレンにブロットしてから切り離し、metylene buleで染色するか（あとで検出したフィルムに並べて位置をマークすればよい）、ハイブリするかして検出するといいでしょう。マーカもDIGで検出すると強すぎでカブったり、ブロードになったりするので染色で検出する方がやりやすいです。 また、メンブレン上のDNAを固定する操作はしていないのですか？ BakingかUV照射が必要です。 RocheがDIG Filter hybridizationの冊子を提供しています。 請求すれば無料で送ってくれますし、WebからPDFをDLすることも出来ます。 それを読んでもらえば、ここに書いた以上のノウハウが得られます。 まずは、それを読んでトラブルシュートすることをおすすめします。 >TK-1さん >0.3Nで20分もいりますか？そもそもバンドサイズが10kb以下ならdepurinationはいりません。 depurinationは好みによると思いますが、したほうが断然トランスファの効率が良いです。検出されるバンドサイズが未知のこともありますから、高分子も常に視野に入れておいたほうが良いでしょう。適度に処理する分には、ターゲットのサイズによらず、感度は上がることはあっても下がることはありません。 塩酸で何分処理するかは、ゲルの濃度や厚さによるので一概には言えません。 わたしは、BPBとXCが完全に変色したらNaOH（& NaCl)に移ります。

その他について 削除/引用 No.1338-7 - 2008/06/16 (月) 10:07:43 - サザン ＞固定の方法は？　 　変性溶液1.5M NaOH 0.5M NaClで15分浸透×2　 ＞ターゲットのサイズは？　 　Ecoで切っているので2〜10kbpくらいでしょうか？周辺の配列が全く分かっていないのでなんとも言えません。 ＞ゲルに残らずきれいにトランスファされていますか？ 　確認していませんでした。マーカーが出ればトランスファは上手く行って　いると判断していました。

(無題) 削除/引用 No.1338-6 - 2008/06/16 (月) 10:05:55 - TK-1 > ・0.3N　HCLで20分間浸透した後に20×SSCを用いてブロッティングしています。 0.3Nで20分もいりますか？そもそもバンドサイズが10kb以下ならdepurinationはいりません。 ところで，denatureはしないのですか？

サザンについて 削除/引用 No.1338-5 - 2008/06/16 (月) 09:37:56 - サザン dot blotでのラベル効率の評価の結果は（何pgのdotまで見えますか）？ すみません。プローブの能力を評価する方法があるということでしょうか？勉強不足でして、こういったことを試してみたことがありません。

サザンについて 削除/引用 No.1338-4 - 2008/06/16 (月) 09:21:25 - サザン ・プローブはroche社のpcr dig probe synthesis kitを用いてPCRで作製しています。 ・メンブレンはpallのメンブレン　biodyne plusを利用しています。 ・0.3N　HCLで20分間浸透した後に20×SSCを用いてブロッティングしています。 ・マーカーはdig ラベルされたRocheのDNA moloculer weight marker �Uを利用しています。10μl(100ng)流して、バンドははっきり確認できます。

(無題) 削除/引用 No.1338-3 - 2008/06/15 (日) 20:51:59 - AP >今回は65℃ハイブリ、洗浄は0.1×SSC　0.1%SDSのかなりな高ストリンジェンシーで perfect matchのプローブならこれくらいの高ストリンジェンシーでも大丈夫だと思いますが。私はふつう（わたしもDIGを使っていますが）、ハイブリは formamideなしで68℃、またはformamide 50%で42℃、最終洗浄は0.1x SSC/0.1% SDS、65-68℃でやっています。 それでも、若干のホモロジーのある配列があると、クロスハイブリしてしまうことがあるくらいですが、そういうときはハイブリバッファーにsalmon sperm DNAなどのキャリアを入れています（DIG標準ではキャリアDNAが入っていない）。 >ゲノムサイズが大きいのでかなり多めに30μg流しています。 十分量以上ではないでしょうか。私が普段扱っている材料はゲノムサイズが1/5程度ですが、mupidであれば1 ugあれば容易に検出できますし、もっとゲノムサイズの大きいmammalsでも数ug〜10 ugもあればできます。 一番怪しいのは、プローブの性能、あとはブロットじゃないでしょうか。 プローブのラベル方法は（Random prime? PCR? その他）？ dot blotでのラベル効率の評価の結果は（何pgのdotまで見えますか）？ 100 bpだと短めなので、ちょっと難しいところが出てくるとおもいますが。 トランスファーの方法は（HClによるdepurinationは行っているか、アルカリトランスファかSSCか、メンブレンの種類は）？　固定の方法は？　ターゲットのサイズは？　ゲルに残らずきれいにトランスファされていますか？ それと、DIGマーカが見えたといいますが、どれくらいの量乗せて、どれくらい見えたのでしょうか（バリバリみえた、かろうじて見えた？） DIGラベルマーカを使ったという事はアルカリトランスファではないのかな？ 情報をあげてくれると、改善できるポイントを助言できるかもしれません。

サザンハイブリダイゼーションのハイブリ温度と洗浄について 削除/引用 No.1338-1 - 2008/06/15 (日) 19:31:55 - サザン ハイブリ温度と洗浄の条件の設定をどうしようか迷っています。もし、皆さんが条件設定の目安としているような基準？のようなものがあれば教えて頂きたいのですが。現在は以下の条件でバンドが出ませんでした。 1、CTAB法で抽出した植物DNA　(800Mbpくらいで6倍体)　ゲノムサイズが大きいのでかなり多めに30μg流しています。 とりあえずEcoR1で処理 2、プローブは100bpほどです。AFLPで検出したバンドを切り出して読んだ配列をもとにしているので、プローブ変更が出来ません。 3、なるべく高ストリンジェンシーで行いたい(非特異的なバンドは出したくない)。今回は65℃ハイブリ、洗浄は0.1×SSC　0.1%SDSのかなりな高ストリンジェンシーで行いました 4、digで検出しています。digマーカーは検出出来ています。 やはりtrial and errorで条件を変えていくものでしょうか？

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