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(無題) 削除/引用 No.1315-15 - 2008/06/17 (火) 23:47:33 - nanba >クマーさん 明日お返しします。m(__)m

(無題) 削除/引用 No.1315-14 - 2008/06/17 (火) 22:16:30 - クマー 高橋昌さん 今日はお昼代貸して頂きありがとうございました。 お金早く返して下さい。困っています。ぐわぁ（泣）ぐすん…

(無題) 削除/引用 No.1315-13 - 2008/06/13 (金) 14:09:57 - クマー 高橋昌さん お疲れさまです。 あっ、変なおじさんだから変なおじさん♪

(無題) 削除/引用 No.1315-12 - 2008/06/13 (金) 01:56:14 - nanba ＞クマーさん そうです、私が変なおじさん・・・ じゃなくて、高橋ではなくて、私はnanbaです。 ランダムプライマーとはプライマーの配列がランダムだということ、 つまり、あらゆる配列のプライマーが含まれたものらしいです。 私の手元にあるプライマーには 長さは（mostly hexamers）と書かれています。 我がラボにあった本に掲載されたプロトコールでは 9mersのランダムプライマーの最終濃度は2.5μＭと書かれていたのですが、 6mers(hexamers)のランダムプライマーの場合、 濃度をもっと高くすべきか低くすべきかがよくわからないため 悩んでいます。 質問にこたえられなくて申し訳ないです。 どなたかご教示をよろしくお願い申し上げます。

ＡＰさんへの返信（２） 削除/引用 No.1315-11 - 2008/06/13 (金) 01:37:22 - nanba ＞ＡＰさんは書きました。 ＞RNAは一本鎖で存在し、塩基がむき出しですので、短い相補配列同士でも自＞己鎖内で水素結合をして二次構造を作ります。そのほうがより安定だから＞ですね。 ＞二次構造の作りやすさは配列によるでしょうし（GC-richだとか、自己鎖内＞にどれだけ相補配列（inverted repeat）になりうる配列があるか）、長け＞れば長いほど確率は上がるでしょう。 ＞RT反応の直前にRNAを70℃とか65℃の熱処理を加えるのは、二次構造を解く＞ためですし、高温で反応できるRTaseが開発されているのも、温度を上げる＞ことで反応中に二次構造を取らないようにするためです ＡＰさんご教示ありがとうございます。 わかりました。とても勉強になりました。

返信が遅れてしまいすみませんでした。 削除/引用 No.1315-10 - 2008/06/13 (金) 01:30:41 - nanba >APさんは書きました ＞RTaseは伸長方向の二重鎖を引っぺがしなら伸長を続けるのではなく、二重＞鎖（前方にアニールしたprimer）にぶつかると止まります（すくなくとも＞ふつうの反応条件では）。 ＞これが、「5'端に近い配列ほど、複数のプライマーから重複して逆転写さ＞れて増幅されるので多くなる」ということでしたら間違いです。 これらについて知らなかったです。重複して逆転写されるのかと 思い疑問に思ったのです。

(無題) 削除/引用 No.1315-9 - 2008/06/12 (木) 12:33:05 - クマ− 高橋さん お疲れ様です。 これ以上いい人を演じるのはやめて下さい。 ひとつ質問ですが、　dT primerではなく、ランダムを用いる場合には、そのprimerの濃度はどのように決めるのでしょうか。 というかランダムとはどういうことをいうのでしょうか？ 配列はもとより、primerの長さもまちまちということもあるのでしょうか？ 高橋さんはどのように今の濃度にしたのですか？？ 御教示ください。 失礼します。

(無題) 削除/引用 No.1315-8 - 2008/06/12 (木) 11:42:22 - AP >RNAの2次構造はどのようなファクタ−に左右され決定するものなので しょうか。 RNAは一本鎖で存在し、塩基がむき出しですので、短い相補配列同士でも自己鎖内で水素結合をして二次構造を作ります。そのほうがより安定だからですね。 二次構造の作りやすさは配列によるでしょうし（GC-richだとか、自己鎖内にどれだけ相補配列（inverted repeat）になりうる配列があるか）、長ければ長いほど確率は上がるでしょう。 RT反応の直前にRNAを70℃とか65℃の熱処理を加えるのは、二次構造を解くためですし、高温で反応できるRTaseが開発されているのも、温度を上げることで反応中に二次構造を取らないようにするためです。

(無題) 削除/引用 No.1315-7 - 2008/06/12 (木) 11:33:28 - nanba >クマーさん 私のラボ内から誰かがかなり昔に購入したものだと思われる ランダムプライマーがでてきたため 今回はそれを使って実験してみることにしました。 GIBCOBRL製のランダムプライマーです。 購入方法は不明です。 それと、私は高橋ではないです。nanbaです。

(無題) 削除/引用 No.1315-6 - 2008/06/12 (木) 11:26:27 - AP >[Re:1] nanbaさんは書きました : > オリゴdＴと同様に５’→３’方向にＲＴされ伸長するものですよね。 > そして、templeteのＲＮＡのどこの配列にも一定の確率で > 結合するものだということでよろしいでしょうか。 > そうならば、ランダムプライマーでＲＴした産物は > ｍＲＮＡの5'側の配列からのものが多くなるのでしょうか。 oligo-dT使うと、途中で伸長が止まってその部分のcDNAが本来より減る可能性があるけれど、randomだとそれがない分多くなるということです。 RTaseは伸長方向の二重鎖を引っぺがしなら伸長を続けるのではなく、二重鎖（前方にアニールしたprimer）にぶつかると止まります（すくなくともふつうの反応条件では）。 ですから、 >ｍＲＮＡの5'側の配列からのものが多くなるのでしょうか。 これが、「5'端に近い配列ほど、複数のプライマーから重複して逆転写されて増幅されるので多くなる」ということでしたら間違いです。 念のため

(無題) 削除/引用 No.1315-5 - 2008/06/12 (木) 11:20:38 - nanba おおさん、APさん回答有難うございます。 ＞オリゴdＴに比べるとそうです。 ＞ランダムプライマーの結合は文字通りランダムですので、RTプロダクトは5＞'、3'には関係なくRNAの全体をカバーできるということになるかと思いま＞す。 ＞一つは、RTaseのprocessivityがあまり高くないことがあり、olido-dT ＞＞primerで長い鎖を一本取りするより、random primerで短いスパンで全体を＞カバーするようにしたほうがよいということ。 ＞もう一つ、重要な点は、RNA templateは二次構造を取りやすく、そこで伸＞長が止まってしまうことです。random primerがあちこちにアニールするこ＞とで、二次構造ができにくくなったり、たとえ二次構造で伸長が止まって＞もその先のプライマーから反応が進むので、二次構造による影響を受けに＞くいのです。 最初私はどの場所にも一定の確立でプライマーは結合するものの、 5'→3'方向に伸長するのなら、逆転写されできたｃDNAは 「RNAの3'側の配列からの産物」よりも「RNAの5'側の配列からの産物」 の方が多く産生されるのではないかと思っていました。 ですがAPさんの回答を見て、逆転写反応はRNAの2次構造にも 依存するということ今回初めて知りました。 ところでとても基本的な質問かもしれませんが、 RNAの2次構造はどのようなファクタ−に左右され決定するものなので しょうか。 よろしくお願いします。

お疲れさまです。 削除/引用 No.1315-4 - 2008/06/12 (木) 11:01:15 - クマー 高橋さん お疲れさまです。 ランダムプライマーの購入はどのようにやられたんでしょうか？ 教えて下さい。 失礼します。

(無題) 削除/引用 No.1315-3 - 2008/06/12 (木) 10:55:55 - AP RT反応は伸長が難しいいろいろなハードルがあって、oligo-dT primingだと、poly A tailからの距離が長くなるほど、途中で止まってしまう割合が多くなって、5'側の配列がunder-representになってしまいます。 一つは、RTaseのprocessivityがあまり高くないことがあり、olido-dT primerで長い鎖を一本取りするより、random primerで短いスパンで全体をカバーするようにしたほうがよいということ。 もう一つ、重要な点は、RNA templateは二次構造を取りやすく、そこで伸長が止まってしまうことです。random primerがあちこちにアニールすることで、二次構造ができにくくなったり、たとえ二次構造で伸長が止まってもその先のプライマーから反応が進むので、二次構造による影響を受けにくいのです。

(無題) 削除/引用 No.1315-2 - 2008/06/12 (木) 01:52:49 - おお >[Re:1] nanbaさんは書きました : > ところで、このランダムプライマーというものは > オリゴdＴと同様に５’→３’方向にＲＴされ伸長するものですよね。 そうです。 > そして、templeteのＲＮＡのどこの配列にも一定の確率で > 結合するものだということでよろしいでしょうか。 理論的にはそうです。 > そうならば、ランダムプライマーでＲＴした産物は > ｍＲＮＡの5'側の配列からのものが多くなるのでしょうか。 > よろしくお願いします。 オリゴdＴに比べるとそうです。 ランダムプライマーの結合は文字通りランダムですので、RTプロダクトは5'、3'には関係なくRNAの全体をカバーできるということになるかと思います。

RT-PCRの逆転写反応（RT）で用いるプライマーについて 削除/引用 No.1315-1 - 2008/06/12 (木) 01:10:49 - nanba ＲＴ−ＰＣＲについての質問です。 私が今RT-PCRで発現量を測定したく考えているものは cDNAの全長が長く、しかも5'よりにprimerのsetを設計しているため ランダムプライマーを用いてＲＴすべきかと考えています。 ところで、このランダムプライマーというものは オリゴdＴと同様に５’→３’方向にＲＴされ伸長するものですよね。 そして、templeteのＲＮＡのどこの配列にも一定の確率で 結合するものだということでよろしいでしょうか。 そうならば、ランダムプライマーでＲＴした産物は ｍＲＮＡの5'側の配列からのものが多くなるのでしょうか。 よろしくお願いします。

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