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(無題) 削除/引用 No.1304-7 - 2008/06/18 (水) 15:11:12 - taka >そして、free p65を測定するのに蛋白抽出はActive Motif社のNuclear Extract Kitを使用し、DNA結合能力のあるfree p65を測定するActive Motif社のTransAM Transcription Factor Assay Kit を使用する予定です。測定するKitはこれでよろしいでしょうか？ それでお知りになりたいことはわかると思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.1304-6 - 2008/06/18 (水) 14:36:01 - ma1230 私が知りたいのはin vivoでPPARγを投与した際にNF-κBが抑制されるが、どこで抑制されているかということです。たとえば肝臓組織をhomogenizeして核蛋白と細胞質蛋白で分離させて、 　核蛋白でfree p65を測定して、もし増加していればPPARγはfree p65が遺伝子結合を抑制されていることがわかり、減少していればPPARγがfree p65の核内移行を抑制していることがわかるし、核内p65が減少しているのにプラスして細胞質蛋白で、もしfree p65が増加していればPPARγは活性化したNF-κBの核移行が抑制されているということがわかるし、free p65の増減がなければIκBαがリン酸化されるのを抑制しているのがわかるのではないかと考えているのです。PPARγが活性化したNF-κBの核内移行を抑制しているという論文はCommensal anaerobic gut bacteria attenuate inflammation by regulating nuclear-cytoplasmic shuttlingof PPARγ and Rel A. Nat Immunol 2004;5:104-112にあります。 　そして、free p65を測定するのに蛋白抽出はActive Motif社のNuclear Extract Kitを使用し、DNA結合能力のあるfree p65を測定するActive Motif社のTransAM Transcription Factor Assay Kit を使用する予定です。測定するKitはこれでよろしいでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1304-5 - 2008/06/18 (水) 11:16:33 - taka ちょっと実験の意図というかが把握しきれていないのですが、たとえば細胞にPPARγを投与したときのp65の局在の変化を顕微鏡で観察すれば細胞質にp65がいるかどうかはわかるのではないでしょうか。で、それがフリーかどうかはたとえばIkBaとp65でFRETをしたりすればわかる気がしますが、知りたいのはそういうことではないんですかね？？

(無題) 削除/引用 No.1304-4 - 2008/06/18 (水) 08:27:03 - ma1230 takaさん貴重なご意見ありがとうございます。 非常に勉強になります。 ＜僕の理解ではIkBaが分解されてマスクされていたNLSが露出するとそこにimportin a/bが結合することができるようになり、すみやかに核移行するのだと思っています。 もちろんIkBaがはずれてimportinに結合するまでのわずかの時間はfreeのp65が細胞質に存在するはずですが、それが検出できるかどうかはわかりません。 →提示していただきました論文を拝見させていただきましたが、その中にもNF-κB dimers（p50/p65, p65 homodimer)はIκBからfreeになっている時に継続的に核内または、核外への輸送されており、p65のNESやIκBαによって、細胞質に輸送されることは可能となっています。よって、importin-αによって核内に輸送はすぐされるかもしれませんが、細胞質内に戻るものもあると考えていいのではないでしょうか？PPARγ投与によって何を促進、抑制しているかはわかりませんが、PPARγによって細胞質内への輸送が促進されるのではないかと思われます。どうでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1304-3 - 2008/06/17 (火) 19:34:45 - 通りすがり p50ってのも一緒についてます。

(無題) 削除/引用 No.1304-2 - 2008/06/17 (火) 17:25:42 - taka 僕の理解ではIkBaが分解されてマスクされていたNLSが露出するとそこにimportin a/bが結合することができるようになり、すみやかに核移行するのだと思っています。 もちろんIkBaがはずれてimportinに結合するまでのわずかの時間はfreeのp65が細胞質に存在するはずですが、それが検出できるかどうかはわかりません。 ↓NFｋBの核移行についての論文です。 http://www.jbc.org/cgi/content/abstract/280/16/15942 思いつくのはこんなとこですかね。

NF-κＢの活性化 削除/引用 No.1304-1 - 2008/06/11 (水) 04:04:29 - ma1230 NF-κBシグナル伝達系においてIκB kinase(IKK)が活性化されてIκBがリン酸化され、ユビキチン化分解されると、転写因子であるNF-κBがIκBから解放され活性化されて、炎症が起きることは周知の事実ですが、疑問があります。NF-κＢが細胞質（Mφなどの）でIκBから解放された際、核内移行する前に、NF-κBのsubunit p65は細胞質内でfreeになっているでしょうか？もし、freeでないなら、IκBから解放されて核内移行するまでにNF-κBはどういう状態にあるのでしょうか？ 　私が知りたいのはNF-κBのfree p65が本当に核内にしか存在しないのかということです。たとえば、western blotやELISAで細胞質内のp65を測定したらfree p65が存在するのではと思ったのです。PPARγがp65の核内移行をブロックするという説もあり、そうなるとp65が細胞質内にたまっているのではと思ったのです。何か知っている方教えてもらえますでしょうか？

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