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LBAmpのコンタミ 削除/引用 No.1264-18 - 2008/06/06 (金) 15:36:13 - ＋ モンテ様、Pumpkin様、そして色々な情報を教えて下さった皆様へ。 皆様が提供してくださった情報を元に、原因を探ったところ、どうも培養スケールを増やしたことによって、シェイクが十分になっておらず、大腸菌自身が沈殿、凝集していたと思われます。 本日の培養では通常通り菌が増殖していました。 最後になりますが、誠にありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1264-17 - 2008/06/05 (木) 22:22:00 - Pumpkin あと、後輩での培養失敗であったのが、プラスミドを多くとりたいと言う事で14mlのチューブで6mlの培養液でやったとき、角度が浅くて攪拌が不十分で翌日には遠心分離したように菌が下に沈んでいたことはあります。それが弱い震盪によってもやもやと立ち上がっていたのも見たことがあります。ただし、そのときは液面での浮遊物はありませんでしたけど。 スケールを大きくするのであればそれに見合って容器もスケールアップする必要があります。管の挿入角度にもよると思いますが、50mlのコニカルチューブで培養するときには10ml位で培養するようにしています（往復震盪で170rpm位だったか）。 先に書いた96wellなんかだと壁と表面張力が結構あるのでそこでコロニーみたく増えてしまうことがあります。静置培養では、菌の沈殿は免れません。ライブラリーを96wellに配列するときは仕方ないですがそこからプラスミドを直接とることはないので問題にはなりません。

(無題) 削除/引用 No.1264-16 - 2008/06/05 (木) 17:50:20 - モンテ 同じような現象だと思うのですが、pDrive（インサート250bps）をトランスフェクトしたXL1blueを培養したところ、白い浮遊物ができたことがあります。pGEX（インサート1300bps）をトランスフェクトしたXL1blueを同時に培養していたのですが、そちらでは白い浮遊物が見られませんでした。 ちなみに私の研究室では、ラボ拡張に伴い試験管培養のシェイカーが足りなくなったため、フラスコ培養用のシェイカーに試験管を立てて代用してます。なので、浮遊物を見たときには、「震盪効率があまりよくないので大腸菌が沈殿したかな？」程度にしか思っていませんでした。 DH5αには何かトランスフェクトしてありませんか？トランスフェクトしたものによっては沈殿や浮遊物ができやすくなったりするのかもしれません。

LBAmpのコンタミ 削除/引用 No.1264-15 - 2008/06/05 (木) 13:39:14 - ＋ Pumpkin様 お返事ありがとうございます。 そんな少容量でも固まりができるんですね。 ファージなどの最悪の事態はあまり考えたくないですし、それが原因であることを祈りたいのですが・・・

(無題) 削除/引用 No.1264-14 - 2008/06/05 (木) 13:28:17 - Pumpkin 96wellで100ul位のvolumeで静置培養すると（震盪してもこのvolではあまり意味がない）、沈殿又は浮遊菌塊ができます。試験管でもvolが多すぎると震盪できずに菌塊がもやもやとなることがあり、良くありません。アプリによりますが、良く増やす必要があるときには、十分な攪拌される必要があります。 お話を聞いていると、培地volが多すぎて震盪が不十分であるように思えます。

LBAmpのコンタミ 削除/引用 No.1264-13 - 2008/06/05 (木) 13:05:22 - ＋ 弘法様 そうですね。早速今日やってみようと思います。 window様 顕微鏡で確認したところ、倍率の関係で目視では大腸菌かそうでないのかは確認できませんでした。後々染色でも確認してみようかと思っています。 また、今一度、振る速度もかなりあげて、今度はLBの容量を少ないものと多いもので比べてみますね。 おお様 コンピのコンタミは以前から密封して保存しているものを使用しているので考えにくいと思っています。本日、Ampプレートと抗生物質なしプレートにまいて比べようと考えています。 AP様 ファージの恐怖は半端じゃないものなのですね。。。 使用してないからといって感染する可能性があるというのは驚きです。

(無題) 削除/引用 No.1264-12 - 2008/06/05 (木) 12:13:51 - AP T系ファージは一般的な組換え実験では使われないので、過去にファージ（lambdaやM13系）を使ったかどうかは無関係でしょう。 もちろんT系ファージは天然にも存在するので、そこからという可能性はあります。ちなみに、過去にIMAGE cDNA cloneのdistributionをしていた会社でT系ファージの大規模な汚染があって、それを購入したラボに汚染が広がった例がありました（ファージを退治するまでのあいだ、ファージに感染している可能性があるけれどそれでも購入するかという念書を取っていました）。

(無題) 削除/引用 No.1264-11 - 2008/06/05 (木) 12:13:07 - おお 顕微鏡を使うと解決の糸口がつかめるかもと私も思います。ファージの可能性はありそうですが、何かカビかもしれません、プレートになるべく薄くまいて、シングルのコロニーを拾って見るのもてかと思います。コンピテント自身がコンタミしている可能性はありませんか?

(無題) 削除/引用 No.1264-10 - 2008/06/05 (木) 12:04:01 - window もし白いかたまりが大腸菌のかたまりであれば それらをピッペッティングしてスライドガラスの上で顕微鏡で見たときに大腸菌しか見えないと思います。 ＞確かに、最近培地の全容量を増やして培養を行っていたのですが、培地全体が揺れるくらいまで振倒速度もそれに従って上げていました。 液量を増やすと全体の液体の混ざりが悪くなります。 とりあえず、もとの少ない液量で行ってみるといいと思います。 振倒は液体が波立って泡泡になるくらいしっかりと行うといいです。 ネガコンとして大腸菌を入れないで液体だけを入れたものも一緒に培養するとよいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.1264-9 - 2008/06/05 (木) 12:00:56 - 弘法 まずはその「コンタミ」が何ものなのか、顕微鏡で観察してみてはいかがですか？また、プレートにストリークしてコロニーを作らせてみては？

LBAmpのコンタミ 削除/引用 No.1264-8 - 2008/06/05 (木) 11:59:41 - ＋ AP様 確かにそれは最悪の事態ですね・・・ ただ、ラボ内（両隣のラボでも）では、少なくとも私が配属されてからの数年間は全くファージを扱っていないのですが、どこからともなく空気中に漂ってやってきたファージが感染したりする可能性はあるのでしょうか？ 抗生物質抜きの培地による、溶菌プラークの検証はやってみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1264-7 - 2008/06/05 (木) 11:43:36 - AP ちょっと怖い、最悪の事態の可能性をあげますが、 大腸菌がファージに汚染されていて、白いかたまりは、培養中に溶菌して生じたdebrisであるのかもしれません。 種菌が感染している場合は、培地や器具の滅菌をしても解決しませんね。 また、ファージ粒子は丈夫なので、培養によって殖えたファージによる汚染が実験環境中にひろがって二次感染が起こり、 ひどいときは、どの大腸菌ストックを培養しても必ず感染して溶菌が起こり、 殖えにくくなったり、プラスミドの収量が下がったりします（そういう事態に陥った研究室があるという話を聞いたことがあります）。 一旦汚染されると、除染するのは困難です（すべての大腸菌ストックを捨てて研究室全体を除染剤で拭き取り清掃するとか、、、）。 また、他の研究室との大腸菌株やプラスミドなどのやりとりで、飛び火する危険もあります。 こういう深刻な汚染はT系ファージ（T1など）で起こるようですが、 最近ではT1/T5ファージ耐性のホストが売られているので（Invitrogenなどから）、とりあえずそれに切り替えてしのぐという手はあります（そういう商品があるということはT系ファージの汚染が珍しいことではないということですね）。 ＞※ちなみに、形質転換時の寒天にはコンタミは見られません。 抗生物質を入れないなどして、bacterial lawn（一面にびっしり生やす）にしてみて、溶菌プラークが生じるかどうか調べてみることをおすすめします。 杞憂であればいいですが。

LBAmpのコンタミ 削除/引用 No.1264-6 - 2008/06/05 (木) 11:37:55 - ＋ window様 培養時間はいつも15時間前後なので、overcultureではないと考えています。 ただ、振倒が不十分のときに大腸菌が固まるというのは知識不足ながら、初めて聞きました。無茶な要望かもしれませんが、もし、その凝集が見た目でわかるような特徴があるものであれば、その特徴をもう少し詳しく教えていただけないでしょうか？ 現在起こっているものの特徴としては（特徴といえるのかはわかりませんが・・・）試験管の底にへばりついて藻のようにふらふらしているものと、培地の水面に浮いているという状況です。 確かに、最近培地の全容量を増やして培養を行っていたのですが、培地全体が揺れるくらいまで振倒速度もそれに従って上げていました。

(無題) 削除/引用 No.1264-5 - 2008/06/05 (木) 11:28:38 - window 白いかたまりというのはただ単にovercultureや振倒が不十分のときに起こりやすい大腸菌のかたまりではないですよね？

LBAmpのコンタミ 削除/引用 No.1264-4 - 2008/06/05 (木) 11:27:41 - ＋ 早速のお返事ありがとうございます。 弘法様 今まで、何本かピペットを変えて操作を行っても結果は変わらなかったので、あまり気にしていなかったというのもあって、シャフトの中のコンタミは考えていませんでした。次は、一旦ピペットを消毒してみようと思います。 むむむ・・・様 はい。オートクレーブ後に入れています。 試験管に関しては密封といっていいのかはわかりませんが、試験管のふたをした状態で乾熱滅菌、保存、使用をしています。 試験管のオートクレーブは初めて聞きました。 参考にさせていただこうと思います。

(無題) 削除/引用 No.1264-3 - 2008/06/05 (木) 11:14:08 - むむむ… LB液体培地はオートクレーブしてから、Ampを1/1000量いれていますよね？ 試験管はシリコン栓などで密封して培養、ですね？ 当方では、大腸菌培養用の試験管は、オートクレーブして乾燥させてから使っています。 一度、試験管をオートクレーブしてはいかがでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1264-2 - 2008/06/05 (木) 11:09:13 - 弘法 ピペッターのシャフトの中がコンタミしているとか？

LBAmpのコンタミ 削除/引用 No.1264-1 - 2008/06/05 (木) 10:43:19 - ＋ こんにちは。いつも拝見させていただいています。 最近、寒天培地から植菌した大腸菌（DH5α）の液体LBによる培養時に、コンタミが続いて困っています（白い固まりが浮いてきます）。原因究明のために可能性を一つずつ潰して行ったのですが、思い当たるふしを全てやりなおしても究明には至りませんでした。今までにコンタミの可能性として疑い、再び行ったのは、 １．Amp入り寒天培地を作り、形質転換 ２．新しい液体LB培地の作製 ３．使用前日に試験管の乾熱滅菌 ４．シェーカーの掃除 ５．エタノールによる使用机の掃除 ６．新しいアンピシリン購入、溶液調整（100mg/mlで-30度、冷凍保存。液体培地への使用濃度は1000倍希釈で行っています。→ex: LB50mlに対してAmp50ul） ※ちなみに、形質転換時の寒天にはコンタミは見られません。 これらを全て行い、さらに、やり方の問題等の可能性を考慮して、私以外にのもう一方にも植菌操作をいままでどおりにしていただきましたが、植菌翌日、同じものが浮いていました。植菌は無菌操作で行っており、今まではこのようなことは無く、急に起こりだしたということもあって、考えられる原因が全く思い浮かびません。 もし、これに対して上記以外の可能性を思いつく方がいらっしゃれば、ご教授お願いいたします。

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