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(無題) 削除/引用 No.1259-9 - 2008/06/06 (金) 13:01:36 - いい おおさん＞ 「私もゲノムに対してデザインしたプライマーの配列でプラストかけますね。で、そう同性が幾らかあっても3'側がマッチしていないようにと心がけます。リアルタイムPCRと言う事なので150bps以下のプロダクトで設計したいですね。」 →教えていただきたいのですが、ブラストはどうやってかけて、調べたらよいのでしょうか？

すごいですね。 削除/引用 No.1259-8 - 2008/06/06 (金) 10:28:08 - モンテ ＞リアルタイムということですが、おそらく文脈からは、SYBR Green系でしょうね。 その通りです。すごいですね（笑。 ＞UCSCのBLAT Search いつもNCBIのBLASTを利用してました。 教えていただいたサイトも使ってみようと思います。 ＞プライマーの設計は、Primer3がいいですね。 皆さん使っているのですね。安心しました。私もプライマー設計に利用しております。 ロシュのライトサイクラーを使ってますが、こちらとも相性が良いみたいですよ。

Re: 削除/引用 No.1259-7 - 2008/06/05 (木) 18:47:54 - UC リアルタイムということですが、おそらく文脈からは、SYBR Green系でしょうね。Taqman系だと、増幅産物は100bp前後が至適とは思いますが、前者なら200bp前後でも問題なくかかると思います。 　ちなみに、ゲノム上に似たような配列がないかどうかチェックしたいとき、自分はUCSCのBLAT Searchを使います。早いですし。増幅される領域の塩基配列を貼り付けて、サーチするだけです。 　http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?org=Human あと、プライマーの設計は、Primer3がいいですね。特にABI系のマシンと相性が良いようで。自分の場合、パラメータでサイズは120-200に指定してます。 　http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3.cgi

ありがとうございます 削除/引用 No.1259-6 - 2008/06/05 (木) 17:33:03 - モンテ 先ほどhahaさんへのお礼の際に「さん」が抜けておりました。すいません。 ＞おおさん ＞リアルタイムPCRと言う事なので150bps以下のプロダクトで設計したいですね。 調べたい標的遺伝子がたくさんあるので複数のプライマーを設計しているのですが、 現在設計した8本は150から250bpsくらいですね。 あと10本くらい設計するので、参考にさせていただきます。 先ほどプライマーを設計していたところ、設計したプライマーと同じDNA配列が繰り返し出てくる領域が見られました。何も考えずにプライマーを設計していたら後々大変なことになるところでした。 皆さんありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.1259-5 - 2008/06/05 (木) 13:50:31 - おお 私もゲノムに対してデザインしたプライマーの配列でプラストかけますね。で、そう同性が幾らかあっても3'側がマッチしていないようにと心がけます。リアルタイムPCRと言う事なので150bps以下のプロダクトで設計したいですね。 かかるかかからないかという観点では近傍であっても良いと思いますが、またいだ方がその領域が存在することを直接言えますのでスッキリはすると思います。 近傍5'側3'側あるいはまたいだものと何カ所かやると言うのも見かげます。

ご回答ありがとうございます 削除/引用 No.1259-4 - 2008/06/05 (木) 10:13:03 - モンテ ＞通りすがりさん ＞cDNAの増幅と異なりゲノムなため類似した配列が目的以外の染色体に存在することがわりとある これは考えておりませんでした。非常に参考になります。 ＞haha ＞CHIPは基本的には、転写因子結合部位をはさむようにプライマーを ＞設計するのではないでしょうか？ そうなのですね。プロトコール集を調べてもこういう基本的なことはわざわざ書いてないようで、ずばっと指摘していただきありがたいです。 早速プライマーを設計してみます。 お２人とも基本的な質問にわざわざ回答してくださりありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1259-3 - 2008/06/05 (木) 08:31:24 - haha CHIPは基本的には、転写因子結合部位をはさむようにプライマーを設計するのではないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1259-2 - 2008/06/05 (木) 07:35:51 - 通りすがり >この転写因子が結合する配列の上流もしくは下流で増幅・検出すべきでしょう >か？それとも、結合する配列をまたぐように増幅しても問題ないのでしょうか？ クロマチンをsonicationした後でcheckしたはずの切断された DNAの平均長に依存します。ゲルに流して平均長がある程度長ければ多少上流でも下流でも増幅されます。ただ長い場合、経験的にIPされる効率は減少するのでPCRそのものが困難になります。逆に短い場合は予測される転写因子の結合領域にかなり近くないとPCRそのものがかかりません、ただIPの効率は高くなるのでbackgorundは低くなります。 >ChIPでのプライマー設計に注意すべき点があれば教えていただきたく思います。 一般的なゲノムの増幅時に設計するのと同じことです。 GCクランプやpolyXがないことやTmやself-dimerなどに注意して設計すればよいです。cDNAの増幅と異なりゲノムなため類似した配列が目的以外の染色体に存在することがわりとあるので、PCRで増幅されても非特異なbandなどがでやすいのでblastなどをかなり厳密に行ってuniqueな領域を増幅することです。 またpromoterなどの場合GC含量が偏ることが多いためPCRそのものの効率が悪くなるためいろいろ工夫する必要がでてくることがあります。

クロマチン共免疫沈降法でのプライマー 削除/引用 No.1259-1 - 2008/06/04 (水) 21:40:44 - モンテ ある転写因子について、標的遺伝子のプロモーターに結合しているかをChIPで確認しようと思います。 この転写因子が結合する配列も分かっていて、ターゲットとなる遺伝子もしぼれています。 なので、あとはこの転写因子に対する抗体で結合したDNAを落としてくるだけです。 検出はリアルタイムPCRの予定です。 そこでプライマーの設計について、経験のある方にご意見いただきたく思います。 この転写因子が結合する配列の上流もしくは下流で増幅・検出すべきでしょうか？ それとも、結合する配列をまたぐように増幅しても問題ないのでしょうか？ 最終的にクロスリンクを外すので、またいでも問題がないと思いますが、ChIPでのプライマー設計に注意すべき点があれば教えていただきたく思います。 どうぞよろしくお願い致します。

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