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助かりました 削除/引用 No.1256-33 - 2008/07/14 (月) 00:04:39 - あべちゃん 仕事が立て続きに入り、かなりレスが遅れてしまいました。 おおさん、 シリカを使ったプラスミド精製、目から鱗でした。今回は、アルカリ／SDS変性法で粗精製したプラスミドを従来の市販カラムで精製しましたが、いつかは試してみたいと思いました。 atsさん、 私も、以前、色々と調べた際に、細胞への毒性はPEG/NaCl沈でかなり改善されました。LiCl沈殿についてはやったことがありませんでした。収量が落ちる点が少し気になったのですが、参考にさせていただきます。ありがとうございました。 APさん、EJさん、 大量にアルカリ／SDS変性でプラスミドを粗精製するのに、非常に助かりました。ありがとうございます。 （ただ7.5M ammonium acetateを調製するだけというのは大量精製にはありがたい） 最後に、どなたかが菌体量とプラスミドの量の関係について話してらっしゃったと記憶してますが、そのことについて。 私はOD600と培養液の体積の積算値、そして実際に取れたプラスミドの収量について記録を取っています。pUC oriを持つハイコピープラスミドの場合、 Plasmid [ug] / (OD600 x Volume [mL]) = 1.5 くらいです。大腸菌の回収時期はOD600=2を超えない条件下です。 そして、今回はじめてampicilinからcarbenicillinに代えて、同様の実験をしたところ1.8に迫る収量でした。 やはり、ampicilinのpHによる“へたり”は、結構無視できないようです。おおさんに指摘いただいた、一度菌を回収し、フレッシュな培地で培養し直せばもっと収量を上げる事ができそうす。（まだ試していませんが）

(無題) 削除/引用 No.1256-32 - 2008/06/20 (金) 10:54:35 - おお EJさま、APさま、情報ありがとうございました。 とぴ主でないのにお礼というのもちょっと変ですが、、、、

AcONH4 削除/引用 No.1256-31 - 2008/06/19 (木) 13:46:55 - EJ 遅くなりました。 これが私が参考にした元文献です。 http://www.invitrogen.com/etc/medialib/en/filelibrary/pdf/focus.Par.98888.File.dat/Focus%20Volume%2011%20Issue%201.PDF 7ページ以降を御覧下さい。 参考になると良いのですけれど。

(無題) 削除/引用 No.1256-30 - 2008/06/09 (月) 13:10:51 - 名無し APさん pHは問題ないんですね。ちょっと感動です。わざわざ臭い酢酸使って調製している奴は、涙目ですね。 クロロホルムもよく目にしますね。でもあれって、そのまま捨てていいもんなんでしょうか？ くまさん >ハイコピーでの出来事ですが、Sol 123の量を推奨量より少なくすると収量が減ります・・多くすると たくさんとれました。 自分の経験では、少なくなるに従ってゲノムの混入が多くなる。あまりにも少ないと収量が低下していくといった感じですね。 リゾチームを使うのも良く見かけますが、自分は上記の理由もあって、なるべくスケールを大きくして溶菌させてます。 >カラム2連にして比較すればいいだけですし、バッファーの組成は書いてあるから作れるし、濾過のシリンジも、てきとうなシリンジの先に0.45umのフィルターをつけるか濾紙で濾すという方法もあるので安いです 0.45umはすぐに詰まってしまうのでは？あと、物理的にせん断されないかとかも気になります。 漏斗とキムワイプでやったことあるんですが、すぐに詰まってなかなか落ちないんですよね。

バッファー量 削除/引用 No.1256-29 - 2008/06/09 (月) 11:07:59 - くま ハイコピーでの出来事ですが、Sol 123の量を推奨量より少なくすると収量が減ります・・多くすると たくさんとれました。 アルカリSDSをルーチンに行っていて、懸濁、溶解の過程には自信があったのですが、いくらデブリがさらさらで中和ばっちり！と思っても、ダメでした。 なので、菌体量に大してsol量を2倍にしてみて収量があがるかやってみてはいかがでしょうか。 カラム2連にして比較すればいいだけですし、バッファーの組成は書いてあるから作れるし、濾過のシリンジも、てきとうなシリンジの先に0.45umのフィルターをつけるか濾紙で濾すという方法もあるので安いです

(無題) 削除/引用 No.1256-28 - 2008/06/09 (月) 10:23:07 - EJ FOCUSだったかな。 GIBCO-BRLの。 精製したプラスミドを37℃で48時間Incしても泳動パターンに変化無し、ってのが出ていたはず。 出典、コピーを見つけたら、また書き込みます。 見つかったとしても、何処かで入手可能かどうか疑わしいけれど。

(無題) 削除/引用 No.1256-27 - 2008/06/09 (月) 09:52:29 - AP 7.5 M NH4OAcはただの水溶液で、酢酸を加えたりpHを調整したりする必要はありません。滅菌水に溶かすだけで調製が簡単なのも私が好んでいる理由の一つです。 昔のことなので出典は忘れてしまいましたが、なにかの雑誌のtechnical tipsの記事だったと思います。ネット上でもKOAcの代わりにNH4OAcを使っているプロトコールが散見されるので、それほど特殊な方法でもないと思います。 私も導入するに当たって十分に中和されるのか気になったので、lysateに加えたあとpHペーパーでチェックしましたが、ちゃんとpH 7程度になりました。 NH4OAcを加えた時点で、NaOHは0.09 Mなのに対してNH4OAcは2.5 Mと過剰量であること、アンモニウムイオンはNa+やK+よりはるかに電離度が低く、Na+存在下では未電離の塩になりやすいことなどで、中和するのに十分なのだと思います。 ついでに、羊土社かなにかの実験書に書いてあったと思いますが、塩を加えると同時に、クロロフォルムを少量（1.5-mLチューブであれば一滴）加えると、 沈殿が壁につきにくくボトムにパックされるので上清がきれいにとれます。 >>（加える体積はSol IIIと同様1/2vol、終濃度5 M)。 >お示しになった濃度はNH4OAc 5Mです。多分一般的なNH4OAcの最終濃度(アルコールを入れる前の)は2.5Mなので、それに準じるということと思いますがどうでしょうか。 書き間違えました。おっしゃるとおり終濃度2.5 Mが正解です。

(無題) 削除/引用 No.1256-26 - 2008/06/09 (月) 08:55:10 - おお たのかたのトピですが、少し質問したく思いました。 >[Re:25] 名無しさんは書きました : > APさん > > NH4OAcはエタ沈に使う、pH調製してない奴でいいんでしょうか？ > 前にネットで見つけた方法だと、Alkali/SDS/エタ沈後に、溶解して行ってました。 >[Re:24] APさんは書きました : > いわゆるSolution III（たぶん5 M KOAc buffer）を7.5 M NH4OAcに変....（加える体積はSol IIIと同様1/2vol、終濃度5 M)。 名無しさんのご指摘のようにpHがきになります。SolIIの中和のためにKOAcは酢酸でpHを可也下げると思いますが、同様pHを調整するのかと言う所が気になりました。 あとKOAcと同様の量という事ですが、お示しになった濃度はNH4OAc 5Mです。多分一般的なNH4OAcの最終濃度(アルコールを入れる前の)は2.5Mなので、それに準じるということと思いますがどうでしょうか。 上げ足を取るつもりはないのですが、１度機会があれば試してみようと思いましたので正確なプロトコールを聞いていこうと思った次第です。

(無題) 削除/引用 No.1256-25 - 2008/06/09 (月) 05:08:18 - 名無し APさん NH4OAcはエタ沈に使う、pH調製してない奴でいいんでしょうか？ 前にネットで見つけた方法だと、Alkali/SDS/エタ沈後に、溶解して行ってました。

(無題) 削除/引用 No.1256-24 - 2008/06/08 (日) 20:01:38 - AP いわゆるSolution III（たぶん5 M KOAc buffer）を7.5 M NH4OAcに変えるだけでもかなりタンパク質が除けたきれいな上清がとれます（加える体積はSol IIIと同様1/2vol、終濃度5 M)。 PCI抽出いらずのAlkali/SDS法として知られているの改変法ですが、実際、その後PCI抽出してもほとんど中間層がでません。これだけではnuclease freeにはならないようで、PCI抽出やカラム精製でさらに精製した方が望ましいですが、粗抽出としてはかなり効果的です。

(無題) 削除/引用 No.1256-23 - 2008/06/08 (日) 17:35:11 - 名無し 自分もatsさんと似たような方法で大量回収してます。 初めてやったときには、LiCl沈殿の沈殿物の量にビックリさせられました。 ロスしてんじゃねえか？って（実際、結構ロスしてるんですけど）

(無題) 削除/引用 No.1256-22 - 2008/06/06 (金) 16:00:02 - ats > ただ、貧乏臭いのですがカラムのDNA結合キャパシティーを９０％も無駄にするのが心苦しくて、色々試行錯誤しているのが現状です。 LB+5g/L glycerolで培養（菌量が増える）＞アルカリSDS＞isopropanol 沈殿＞TEに溶解＞LiCl沈殿＞上清＞sopropanol 沈殿＞TE＋RNaseに溶解・保温＞PEG/NaCl沈殿＞TEに溶解＞塩濃度を合わせカラムで精製　では、いかがでしょうか。 LiCl沈殿+PEG/NaCl沈殿でかなりの不純物が除けます。

(無題) 削除/引用 No.1256-21 - 2008/06/06 (金) 10:35:59 - おお http://www.tamza.com/moscow_1995/plasmid.html キット使わないでという事であればこう言うのが参考になると思います。シリカをDNA精製に採用している会社は結構ありますので、ほぼ同じことをしていると考えてます。LPSについては何処まで除けるか分かりませんが、どなたかの指摘のようにTRITONーX114と組み合わせればいいかもしれませんね。わたしは、DNA溶液を6MUreaにして、酢酸ナトリウムでえたチンすることで、どなたかがキットを使わずに得たDNAの毒性をかなり軽減したことがあります。たいていの細胞株では大丈夫なようです。 そんなこんなといろいろやっていくうちに、キットは必要ないんじゃないかと思い始めているこの頃です。 pBRのoriだとたしかに収量は1lでそんなもんかとも思います。私は500mLの2YTで50mlの大腸菌けんだく液を移し、4ー6時間後にバイチを更新し1時間後には回収して精製を始めてしまいます。こちらのほうが死菌が増えたりとか(多分その他の理由もあると思いますが)ゲノムを拾うことが少ないからです。対数増殖期の間に回収してしまうので菌の数は普通のプロトコールより少ないと思っていますが、pUC系のoriで5mg(500mLから)以上取れることがしばしあります。そう考えるとpBR系でも1lも使えば500ugは取れるかもしれないとも思うわけです。どなたか菌体数から収量を見積もった方はいませんかね、、、、

(無題) 削除/引用 No.1256-20 - 2008/06/06 (金) 10:01:11 - あべちゃん >[Re:19] かいあじぇんさんは書きました : > 単純にスケールアップしてメガプレップやギガプレップを使うのではだめなの？ メガにすれば、500ugほど取ることができますね。 ただ、貧乏臭いのですがカラムのDNA結合キャパシティーを９０％も無駄にするのが心苦しくて、色々試行錯誤しているのが現状です。 でも、時間とコストを考えて、かいあじぇんさんが仰るように、メガプレップなどを使うかもしれません。今回はローコピープラスミドを大量に取るコツという事で、トピックを立ち上げさせていただきました。お許しください。 >[Re:18] APさんは書きました : > どれくらいの培養スケールから始めたのか、どこのキットを使ったのかは分かりませんが、Qiagenに準じたMaxiスケールであれば、妥当な収量であったのではないかと、 APさんのご推察通りです。理論的には予測通りの収量なので、インサートが悪さをしている可能性は少ないので、単純に培養量を増やしてやればうまくいきそうです。 >[Re:17] おおさんは書きました : > わたしが、大腸菌を回収して、バイチを更新すると書いたのもこれが理由です。 >[Re:16] 中年さんは書きました : > アンピシリンの分解はβラクタマーゼによる酵素反応なので、アンピシリンを追加した程度ではほとんど無効です。先に書いたようにβラクタマーゼを含んだ培地を一度洗い流すことが必要でしょう。 おおさん、中年さん、 ご指摘ありがとうございます。そうするつもりです。

(無題) 削除/引用 No.1256-19 - 2008/06/05 (木) 15:40:52 - かいあじぇん 単純にスケールアップしてメガプレップやギガプレップを使うのではだめなの？

(無題) 削除/引用 No.1256-18 - 2008/06/05 (木) 14:36:04 - AP 蛇足ですが、 pUC系のコピー数は500〜700、pBR系は15〜20とされていますから、 単純計算で、pBR系の収量はpUC系の1/25以下です（クロラムフェニコールを使わない場合）。mLあたり、pUCで3 ugとれるとしたらpBRでは100 ngくらいですね。 low copyをQiagenのMaxiで精製する場合、2.5 L LB 培養液で収量最高で500 ug (予想収量100〜500 ug）と記載されています。 なので、 >１回で500ug位は欲しいのですが、普段用いている某メーカーのMaxiスケールで調整後フェノクロ／エタ沈した後の収量では物足りない感じです。 どれくらいの培養スケールから始めたのか、どこのキットを使ったのかは分かりませんが、Qiagenに準じたMaxiスケールであれば、妥当な収量であったのではないかと、

(無題) 削除/引用 No.1256-17 - 2008/06/05 (木) 12:18:07 - おお >[Re:16] 中年さんは書きました : > アンピシリンの分解はβラクタマーゼによる酵素反応なので、アンピシリンを追加した程度ではほとんど無効です。先に書いたようにβラクタマーゼを含んだ培地を一度洗い流すことが必要でしょう。 わたしが、大腸菌を回収して、バイチを更新すると書いたのもこれが理由です。

(無題) 削除/引用 No.1256-16 - 2008/06/05 (木) 11:14:16 - 中年 アンピシリンの分解はβラクタマーゼによる酵素反応なので、アンピシリンを追加した程度ではほとんど無効です。先に書いたようにβラクタマーゼを含んだ培地を一度洗い流すことが必要でしょう。

多謝です 削除/引用 No.1256-15 - 2008/06/05 (木) 03:00:02 - あべちゃん >[Re:14] 核さんは書きました : > Endotoxin Removal solution という名前でシグマからでています。 > http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search/ProductDetail/SIGMA/E4274です。 商品化された便利なものがあるんですね。大量のカルチャーからプラスミドを濃縮・精製するとLPSの混入が問題化する可能性がありますから、その時に参考にさせていただきたいと思います。 >[Re:13] 中年さんは書きました : > ただ、気になるのは収量が少な過ぎる点です。500ugでしたらpBR322由来のプラスミドでもLBで1Lも培養すれば取れる量だと思います。お使いのプラスミドに特有の不安定性があることが疑われます。 確かに、培養中にプラスミドが脱落している可能性は高いです。シングルコロニーを植菌し、1mLカルチャーからアルカリSDS法で抽出した方がプラスミドの収率が高い傾向にあります。 アンピシリンの追加やカルベニリンについて、実際に検討しようと思います。 >[Re:12] APさんは書きました : > 実際、それでうまくいっているのならいうことないですが、一般的にはフェノール抽出ではエンドトキシン（リポ多糖）は除けないといわれてますね。 えぇ。この操作では効率的なLPSの除去は難しいです。おそらく、別の夾雑物（特にPCI時の中間層に見られる蛋白質らしきもの）を除去したことによる効果だと思います。 >[Re:11] う〜んとさんは書きました : > 最近のキットの中にはエンドトキシンフリーを謳っているものもあります。 > 変性剤を含む液体でウォッシュする工程が追加されてるようです。 > ご参考まで。 invitrogenさんが、よく販促に来られてます。ただ、この手のキットにおいてプラスミド収量が低いのが玉にきずのように思います。 皆さん、色々な情報ありがとうございました。 幾つかのポイントを踏まえて、transfection compatibleかつ十分量のプラスミドが取れるのかを、実際に調べてみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.1256-14 - 2008/06/04 (水) 18:39:12 - 核 エンドトキシンはフェノクロではある程度しか除けませんが、TritonX114を使った相分離法でほぼ除去できますよ。自分でも実は簡単にできますが、Endotoxin Removal solution という名前でシグマからでています。 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search/ProductDetail/SIGMA/E4274です。これを使った方が、エンドトキシン除去をうたったカラムを使うよりずっと安上がりになります。効果は、変わらないくらい有効な感じです。

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