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(無題) 削除/引用 No.1252-9 - 2008/06/04 (水) 22:19:02 - protein APさん ご指摘ありがとうございます。参考になります。 タイポに関しては、指摘されて気が付きました。 お恥ずかしい・・・・

(無題) 削除/引用 No.1252-8 - 2008/06/04 (水) 14:39:55 - AP >ちなみに、目的のタンパクは転写因子のHIF1alphaです。 protein-protein associationに携わる疎水性の高いPAS domainがありますね。 この場でもたびたび指摘されているように、膜タンパク質のような疎水性の高いタンパク質はboilでアグリやすいということがいわれていますから、条件によってはPASもそうなるかもしれません。低温でゆっくりSDSとカップリングするといわれていますが、熱をかける前のsonicationで迅速にそれがおこっているのかもしれません。想像に想像を重ねていますが。。。。。 ずっとタイポしてますよ→viol

(無題) 削除/引用 No.1252-7 - 2008/06/04 (水) 13:13:22 - protein sonicationですが、sonication無しでvoilした後に、サンプルを冷凍保存しているんですが、後日にloadingする前に、時々サンプル内に塊が確認されたことがあったので、その時はsonication後にloadingしてＷＢを行ないました。 このときも大きなサイズとして検出されました。 やはり、サンプルバッファーに溶かす際のsonicationが重要なのでしょうか? voil後のsonicationでは意味ないのでしょうか? いずれにしても、皆様の意見を参考にして、sonicationの有無でサンプルを調整し、再度実験を行なってみたいと思います。 ちなみに、目的のタンパクは転写因子のHIF1alphaです。

(無題) 削除/引用 No.1252-6 - 2008/06/04 (水) 11:49:13 - AP どちらの結果が正解かどうかというのは置いておいても、結果の差異とsonicationの有無が相関しているのですから、そこに原因がありそうだという事は想像できますね。 side-by-sideでsonicationありなしを試してみてはどうでしょうか。 sonicationしたほうが妥当な結果が得られるということになれば、 細胞の破砕とは別にしても、サンプル調製のプロトコールにsonicationを入れることにすれば良いと思います。 120 kDaが正解で150 kDaはartifactだとしたら、120 kDaはほかの物質と複合体を作っていて、sonicationなどでよくdissociateしないでboilするとaggregationをおこすとか（想像）。 市販の抗体を使っているとのことですので、差し支えなければターゲットがなにかを明かしてもらえると可能性が絞れるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1252-5 - 2008/06/04 (水) 11:46:58 - よっしー まずはソニケーション有りと無しのサンプルを 並べてウエスタンブロットしてみればいかがでしょう． 目的タンパクを発現しているのは，原核生物ですか？ 真核生物なら，糖付加などによりアミノ酸配列から予測される サイズより大きくなることもありえる話です．

(無題) 削除/引用 No.1252-4 - 2008/06/04 (水) 11:23:53 - protein 早速のお返事ありがとうございます。 目的のタンパクは120kDaです。 このsizeは抗体が認識しうるサイズであると、抗体の会社のデータシートにも書いてありますし、以前まではこのサイズにしっかり見えていました。 使用しているゲルは7.5% 10%の両方試しましたが、 最近の結果では、同じくサイズが大きい方にシフトしています。 ちなみに、タンパクのサイズなんですが、抗体の認識しうるタンパクのサイズは120kDaですが、配列からの予想されるサイズは100kDaより少し小さいサイズで、現在バンドが見えている位置（150kDaくらい）にはならないと思うのですが・・・ 抗体の活性が落ちてたり、コンタミしてる可能性があるのかな?と考えてもいますが、そのことでサイズが大きくなるということは、勉強不足のため聞いたことがありません。

(無題) 削除/引用 No.1252-3 - 2008/06/04 (水) 11:07:42 - AP ＞以前まではサンプルバッファーに溶かすときに、細胞の塊が残っていたため、ソニケーションした後でvoilしていましたが、最近は塊が残っていないので、voilをそのままして、gelへのloadingに使用しています。 大変おおきな違いになるかもしれませんよ。 sonicationでcleavageが起こるタンパク質もあります。 以前のsonicationしたサンプルの方が分解していて、今の、していないほうがintactなんじゃないですか。

(無題) 削除/引用 No.1252-2 - 2008/06/04 (水) 11:05:40 - りょう 何キロダルトンくらいシフトしているのでしょう？ 何パーセントゲルで泳動されているのですか？

タンパク質のサイズの変化 削除/引用 No.1252-1 - 2008/06/04 (水) 10:53:24 - protein いつも拝見して、参考にさせていただいています。 現在ＷＢでのタンパク質の検出を行なっていますが、 ここ最近疑問に思うことが出てきました。 細胞に対して同じ処置（刺激など）をし、 同じ手技（抗体も含めて）で検出ているにも関わらず、 今までに検出できたタンパク質のサイズよりも大きいサイズが検出されてしまいます。 バンドは1つしか出ないですし、発現パターンも同じなので、 目的タンパクに間違えは無いと思うのですが、 このようなことは起こりうるのでしょうか?また、原因は何でしょうか? 分解が起こってサイズが小さくなるなら納得できますが・・・ マーカーに関しては、他のタンパクを検出すると、そのサイズは間違いが無いので問題は無いと思います。 唯一処理として違うことは、 以前まではサンプルバッファーに溶かすときに、細胞の塊が残っていたため、ソニケーションした後でvoilしていましたが、最近は塊が残っていないので、voilをそのままして、gelへのloadingに使用しています。 皆様の意見を聞かせてください。

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