>[Re:1] INVSc1さんは書きました :
> onehybridで転写因子候補を見付けました。そこから完全長のcDNAを手にいれてゲルシフトをしようとしたのですがうまく蛋白ができません。
どんな系を使っているのでしょうか?その辺をある程度提示したら、情報を提供できる人もあるのではと思います。どうしてもだめと言うなら、DNA結合部位がモチーフから推測できるならその部分のフラグメントを合成するのも手かもしれません.
> 一般的にDNA結合能の解析にはゲルシフトが用いられますが、
どこまでを一般というかで意見が分かれるかもしれませんが、もっといろいろなアプローチは可能だと思いますよ。
> この完全長のcDNAを使ってもう一度onehybridをした方が、結合する領域はゲルシフトよりも狭くていいような気がするのですが、onehybridでは証明できないのでしょうか？教えてください。
この事についてはお答えが提示されていますし、私もonehybridでは証明は弱いと思います。DNAに結合することが示唆されたわけですから、DNAの結合性をほかの系で示すか、転写などに対する影響をしらべ、生理的に意味があるかどちらかのアプローチになるかと思います。結合性に行き詰まっているなら後者をを優先しながら、結合の方はその間に実験系を考えるというのもてかと思います。
また、例えば細胞などにタグつきで 過剰発現させて、その(核)抽出ぶつがゲルシフトなどで、そのターゲットの配列と相互作用し、タグの抗体でスーパーシフトが起こるなら、直接かどうかはさておき、より生理的な意味を問えると思います。 |
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