APさん、おおさん、ありがとうございます。
＞Poly[d(I-C)]の役目は、配列に非特異的なDNA結合タンパク質をtitrate-outする（配列非特異的なタンパク質の結合でバンドシフトが起こらないようにする）ことですから、アグりを解消するのには効かないと思います。
たしかに、Polyをいくら増やしても解消されませんでした。。
＞＞これを目的因子が透過しない大きさのポアをもつマイクロコンで精製しても問題ないでしょうか？
＞むしろ、アグリゲーションを起こしている高分子をカットするようにしたほうが良いように思います（単なるカン）。
私も高分子がアグっているのだと思っていたのですが、microcon30で精製した結果、トップのアグリがほとんどなくなったので、低分子も含まれているということでしょうか…（絡まったりして？）
しかし、アグリがなくなったのはいいのですが、今度はネガコンに、いつも出ていなかった非特異バンドが出現してしまいました。通常反応液の最終塩濃度は核抽出物に含まれている分も計算して、150mMくらいにしていたのですが、今回は精製して脱塩したこともあり、120mMくらいになっていました。こんなわずかな差で非特異結合が形成されることはあるのでしょうか…？
（文献によると私の解析している転写因子は、100mMで結合効率が最高になり150mM以上では結合力がなくなっていくかんじなので、非特異結合を防ぎつつ、目的因子の結合も損なわないようにぎりぎり150mMまで上げていました。120mMでも大丈夫かなと思ったのですが…）
＞反応後の遠心は1500ulチューブようの遠心ぐらいしか使えないでしょうから、最高回転で5分ぐらいかなと思います。DNAとの相互作用でなくて、RNAータンパクのコンプレックスでもゲルのトップにアグリゲートが来ることがあり、それを除くのに同様のプロトコールがあります。
反応前の核抽出物であればもし抽出した時に強い遠心をかけてないなら、30000gで30min以上というしっかりした遠心をかけてみてもいいかもと思います。
ここの遠心機は最高回転で16000gまでしかでないのですが、最高回転とは30000gのことですか？やったことないのですが、反応後遠心して上清をアプライするとは、反応後の上清を遠心すると何か沈殿ができるのでしょうか？（ちなみに私は放射能ではなくて、DIGで標識したプローブを用いています。）
どうぞ宜しくお願いします。 |
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