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(無題) 削除/引用 No.1241-8 - 2008/06/02 (月) 19:41:50 - K みなさま、ありがとうございます。 同じライブラリーから、クローニングされた遺伝子用のprimerが見つかったので、 まず、それを用いてPCRを行いたいと思います。 それから、スケールについても、20 ulで行うことといたしました。 アドバイスありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1241-7 - 2008/06/02 (月) 19:30:16 - AP 一回目のPCRで薄くバンドが見えた→少量取って二回目のPCRをかけたらバンドが出なかった これは、一回目のPCRで出たバンドはartifactだということじゃないですか。 ホンモノならば二回目のPCRのほうが圧倒的に増えやすいはずですから。（低分子量のもやもや以外、サイズの違うバンドが出ないのですよね）。 artifactだったから、libraryからPCRをやり直したとき何も増えなかったのだと考えればスジがとおります。 ここは一度は増えたように見えたという事は忘れて、最初からプライマー、鋳型を見当し直した方が良いのではないでしょうか。 ＞0.5 ul用いて、10 ulのスケールで再度PCRを行ったところ、 蛇足ですが、クローニングなどの目的でPCR産物を取得するなら、もっと大きいスケールのほうがいいのでは。

(無題) 削除/引用 No.1241-6 - 2008/06/02 (月) 19:24:40 - りょう 僕なら取りあえず25mer以上に伸ばして35-40サイクルかけてみますが。 1st PCRですんなり行かないことを見越して序でに外側のプライマー発注しておいてnested-PCRします。 ゲル切り出し産物を2nd PCRの基質に使用して、全然かからないことありますよ。

(無題) 削除/引用 No.1241-5 - 2008/06/02 (月) 19:05:14 - ~ In silicoの解析は市販品を用いたのでしょうか？ ImageCloneなどで購入できませんか？ 買えない条件で、最短で目的の配列を回収するのであれば、 cDNAを取り直すための細胞を増やす 違う組み合わせのプライマー発注 cDNA合成 何通りかの組み合わせでPCR(ポジコンとして、そのcDNAで増えるはずのプライマーも置く) だと思います。

(無題) 削除/引用 No.1241-4 - 2008/06/02 (月) 19:00:15 - K >あかね様 最初のPCR産物、とは、cDNA library由来のもののことでしょうか？ それすらも増えなくなっているのです。 >りょう様 >その中に入れる酵素量は0.1マイクロリットルとかですか？ ご指摘の通りです。 ライブラリーが４種類あるので、種類分＋１本でプレミックスを作っています。 0.5 ulなら、P2でもP10でも取れると考えております。 ですので、反応液が間違っていることは考えにくいと思います。 >何merのプライマーでTm60ですか？もう少し長くしてTm上げても良いと思います。 >あとサイクル数はどのくらいなのでしょう。 失礼いたしました。 20 merでTm=60です。 サイクル数は、cDNA libraryからの増幅も、PCR反応液をテンプレートにしたPCRでも３０です。

(無題) 削除/引用 No.1241-3 - 2008/06/02 (月) 18:51:59 - りょう 10マイクロリットルの系でのPCRですか。 その中に入れる酵素量は0.1マイクロリットルとかですか？ チップの先に入るか入らないかのレベルでコチョコチョやって再現性良くPCRかけられる程の腕が確かなのでしょうか？ もう少しスケールを大きくした方が良いのでは？ ただでさえPCRなんてトリッキーな手法でしょう。 最初にかかったバンドも本当かどうかわかりません。 何merのプライマーでTm60ですか？もう少し長くしてTm上げても良いと思います。 あとサイクル数はどのくらいなのでしょう。 情報少なすぎて何とも言えないレベルですね。

切り出し 削除/引用 No.1241-2 - 2008/06/02 (月) 18:24:50 - あかね 最初のPCR産物を電気泳動し、目的のバンドを切り出すべきです。 切り出したものをPCRにかけてみてください。

PCRの再現性 削除/引用 No.1241-1 - 2008/06/02 (月) 18:03:32 - K いつも勉強させていただいております。 さて、このほどin silicoにて、遺伝子断片を見つけることに成功したので、 全長をクローニングすることになりました。 1) in silicoで得られて配列を基にPrimer 3でPrimer pair(Tm=60)を設計しました。 このprimerを用いて、熱で不活化したcDNA libraryをテンプレートにしてPCRを行ったところ、 予想分子量に合致するバンドを得ることができました。 2) ただし、若干薄いと感じられたので、このPCR産物100倍に希釈したものを0.5 ul用いて、10 ulのスケールで再度PCRを行ったところ、バンドを得ることができませんでした。 3) 2)のテンプレートにアニール温度を50-60度の間で５点採って、PCRを行ってもバンドを得ることができませんでした。 4) さらに、悪いことに、cDNA libraryからのPCRもうまくいきません。こちらもアニール温度を振ってみましたが、バンドは得られませんでした。 5) うまく行かない場合、BPBラインよりも下側に、ぼんやりとしたバンドを確認できます。 6) ポリメラーゼやdNTPなどは他の人でworkしているものを用いました。 以上をふまえると、 ・Primer の劣化　<- 10 uM に調製して１ヶ月も経過していません。-20℃で保存。凍結融解は６回程度 ・cDNA libraryの劣化 <- この可能性が濃厚と考えております。 他にどのような可能性が考えられますでしょうか？よろしくお願いいたします。

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