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ありがとうございます 削除/引用 No.1233-9 - 2008/06/05 (木) 10:19:50 - Hsan みなさん、コメントありがとうございます。 アドバイスに従って、もう少し検討してみます。

(無題) 削除/引用 No.1233-8 - 2008/06/05 (木) 09:29:45 - sea 膜蛋白ではなおさらかもしれませんが、 一般的に新しい抗体でWBをはじめるときにはnature とdenatureの 両方の状態でどちらの状態をより抗体がよく認識するか条件検討 するものでしょうから、 unboilでやってなければ、両方のサンプルをside by side で やってみてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1233-7 - 2008/06/04 (水) 20:09:18 - ba Hsanさんへ すみません、そのような特殊なパターンでのウエスタン検出はしたことがないので、正直どうなのかわからないです。すみません。少なくとも、ＡＱＰについては低温でのインキュベートをお勧めしますよ。

(無題) 削除/引用 No.1233-6 - 2008/06/04 (水) 19:11:52 - ボイラー 関連したトピックが以前にも何度も立っています。 このフォーラムか古い方のフォーラムで、「膜タンパク質」「ボイル」「ＳＤＳ」等をキーワードに検索してみてください。

(無題) 削除/引用 No.1233-5 - 2008/06/04 (水) 18:52:19 - Hsan Baさんお返事ありがとうございます。 >膜貫通領域があぐるかなんかだと思ったのですが、膜タンパク質の場合はボイルではなく70℃で10分間程度、もしくはもっと低温でインキュベートして流すのが良いと思いますよ。37℃で30分というのも聞いたことあります。 私はゴルジの膜に局在する糖転移酵素（ゴルジの膜タンパク）の遺伝子をGFP融合タンパクとして発現させました。 分子量は43kでしたが、anti-GFPでimmunoblotするとよそうされる分子量以外に200kを超えるbandもいくつか出現しました。 もしかしたらBaさんがいうように、TM domainを持つ故にアグっていうということなのでしょうか？私は細胞を1% TritonX-100で細胞を壊した後、遠心して、その上清に2-MEを加えて100 ℃, 5 minのboilをしていました。 これが高分子量領域にanti-GFPで染まるbandが出現した最も考えられる理由なのでしょうか。 ご存知でしたらご教授ください。

(無題) 削除/引用 No.1233-4 - 2008/06/04 (水) 16:42:47 - ba 膜貫通領域があぐるかなんかだと思ったのですが、膜タンパク質の場合はボイルではなく70℃で10分間程度、もしくはもっと低温でインキュベートして流すのが良いと思いますよ。37℃で30分というのも聞いたことあります。

(無題) 削除/引用 No.1233-3 - 2008/06/03 (火) 19:06:02 - Hsan コメントありがとうございます。 >>アクアポリンは膜タンパク質なので、高温でdenatureするとあぐってしまい、 初めて聞きました。 初心者ですので教えて下さい。これは膜タンパクだとこういう現象がおこるというコンセンサスがあるんでしょうか？ なぜ膜タンパクだと高温でアグルのでしょうか？ 質問に質問を重ねてしまいすみませんが、ご教示いただければ幸いです。

(無題) 削除/引用 No.1233-2 - 2008/06/03 (火) 18:05:55 - ba 電気泳動前のサンプルは熱処理を行っていますか？アクアポリンは膜タンパク質なので、高温でdenatureするとあぐってしまい、適切なバンドが得られないことがあります。

AQPsのウエスタンブロット 削除/引用 No.1233-1 - 2008/06/01 (日) 17:36:31 - Hsan アクアポリンのウエスタンを経験された方がいらっしゃれば、教えて下さい。 現在、マウスの腎臓から抽出した試料で、アクアポリン（２と３）のウエスタンブロットを行っていますが、非特異バンドが多くて困っています。抗体は市販のものを３種類試してみましたが、添付のプロトコールどおりに行っても、どれも文献とは異なるパターンになってしまいます。培養細胞でのpp38や他の臓器でのリン酸化タンパクのウエスタンなどは上手くいっているのですが。。。 アクアポリンの場合、特に注意すべき点などあるのでしょうか？

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