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(無題) 削除/引用 No.1230-10 - 2008/06/02 (月) 04:15:04 - おお >[Re:8] 通りすがりさんは書きました : > 横入りしてすみません。 > おおさんのおっしゃられることに少し伺いたいのですが、 > 硫安沈殿で培養上清の濃縮を行うとアセトン濃縮と比較して、アルブミンのコンタミが少ないということでしょうか？硫安沈殿だとアルブミンの沈査への持込が少ないのでしょうか？ > このことについてはさんがコメントしていらっしゃる通りです。 >[Re:9] りょうさんは書きました : > 確かに硫安やってもいいでしょうが、段階的にパーセント上げていって目的蛋白が沈殿し、不必要な蛋白の割合が低くくなる条件を決めるべきでしょう。 タンパクによって沈殿してくる硫安濃度が違うので、分けれる可能性があるので利用できる場合があります。すでにその分泌タンパクの精製とかで硫安を使っている報告があるなら条件はつかみやすいでしょう。いずれにせよ予備実験した方がよさそうです。

意見がかぶりますが 削除/引用 No.1230-9 - 2008/06/01 (日) 23:33:57 - りょう 実験系に悪影響を及ぼさないなら無血清培地を使用した方が良いでしょう。 おおさんの仰るように血清由来蛋白は分泌蛋白より圧倒的に多いでしょうから。 アセトンやTCAで沈殿させても不溶下してしまう率が高いでしょう。 SDS-sample bufferなどに溶かすのなら話は別ですが。 確かに硫安やってもいいでしょうが、段階的にパーセント上げていって目的蛋白が沈殿し、不必要な蛋白の割合が低くくなる条件を決めるべきでしょう。 アミコンやザルトリウスなどから販売されている遠心濃縮器の利用も可能かもしれませんが、いずれにせよ血清蛋白を除いておかないと全然濃縮されません。 どうしても血清ありでやりたいなら、除アルブミンカラム・除イムノグロブリン・除トランスフェリンあたりはカラムが販売されているでしょうからそれらを除いて濃縮にもっていくべきでしょう。

(無題) 削除/引用 No.1230-8 - 2008/06/01 (日) 22:16:24 - 通りすがり 横入りしてすみません。 おおさんのおっしゃられることに少し伺いたいのですが、 硫安沈殿で培養上清の濃縮を行うとアセトン濃縮と比較して、アルブミンのコンタミが少ないということでしょうか？硫安沈殿だとアルブミンの沈査への持込が少ないのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1230-7 - 2008/06/01 (日) 18:21:06 - おお > > >>おおさん > お返事有難うございます。培地は血清ありを用いる予定でいます。 > 通常、分泌蛋白の濃縮には無血清培地を用いるのが一般的なのでしょうか？ 精製を行う時は、無血清や、低血清で行う事がおおいです。あとは血清成分由来の物を見ている可能性を避けるために無血清バイチを使うこともあります。 精製の時このような選択をする理由の一つに血清はあまりにも多量のタンパクを含んでいるという事があります。 精製するのに邪魔なわけです。 今回の質問は精製ではないのですが血清には32-50gものタンパクが1L中に含まれてます。10%の血清を含むバイチで10uLのせるとすでに30ugのたんぱく質を載せたことになります。系によりますがSDSPAGEで100ugのせるとキャパ的に可也無理がある状態ですし、30ugでも、血清のたんぱく質はほとんどがアルブミンで、30ugが一つのバンドとして得られるような状態で電気えいどうがそんなにきれいに流れない状況だと思います。 で3mLのバイチをを濃縮するわけですよね。濃縮しないバイチ10uLでこんな状態です。濃縮しても総たんぱく質量を測って適切なタンパク量をのせようとすると、濃縮前のバイチを数uL取って流すのと同じスケールになってしまいます。 そう言うのを考慮して硫安という選択肢を提示したわけです。

(無題) 削除/引用 No.1230-6 - 2008/06/01 (日) 17:28:00 - L アセトンなりTCAなりで変性させて沈殿させると、(硫安やPEGは大丈夫っぽい) タンパク質は生理的なバッファーには溶けにくい、または、溶けないようです。 沈殿をウォッシュして乾燥させたあとは、いつも2xSDS Sample Bufferに溶解しています。 二次元電気泳動の場合は、二次元用のサンプルバッファーでよろしいかと思います。 それから、培地の件ですが、論文では、 1) 単純な培養は、血清含有培地 2) タンパク質の精製を行うときは、無血清培地で培養する というのが一般的のようです。 これは、精製時に極々微少量の培地由来のタンパク質のコンタミが懸念されるからでしょう。

(無題) 削除/引用 No.1230-5 - 2008/06/01 (日) 09:37:43 - K > >>遠心でアセトンを除去したのち室温で風乾し、その後Buffeで再溶解しますが、 > > この時のbufferは塩の入っていないただのwaterの方がいいのでしょうか？ 水では溶解する蛋白に限界があると思います。使われる蛋白定量法に合わせて、試薬に影響を及ぼさない組成のバッファーを用いられると良いかと思います。 > コールドエタノールで不溶性の蛋白を可溶化できるとのこと、初めて知りました。この時のエタノールの％はいくつで行えばいいのでしょうか？ > エタノールリンスのタイミングは、アセトンで落として風乾後、ですよね？ > それから再度dry upでよいでしょうか？ 書き方が悪かったかもしれませんが、不溶性の蛋白を可溶化するわけではありません。アセトンによる脱脂によって解けにくくなってしまう場合があるのです。100％のコールドエタノールでさっとリンスして(アセトンを除去するようなつもりで）エタノールを取り除き、風乾します。それでも溶解性は（ものによっては)改善しづらいかもしれません。 　私はこの方法でうまくいっていますが、他の方のアイディアも伺えるといいですね。

(無題) 削除/引用 No.1230-4 - 2008/06/01 (日) 09:10:08 - 学部学生の初心者 Kさん お返事有難うございます。 >>遠心でアセトンを除去したのち室温で風乾し、その後Buffeで再溶解しますが、 この時のbufferは塩の入っていないただのwaterの方がいいのでしょうか？ コールドエタノールで不溶性の蛋白を可溶化できるとのこと、初めて知りました。この時のエタノールの％はいくつで行えばいいのでしょうか？ エタノールリンスのタイミングは、アセトンで落として風乾後、ですよね？ それから再度dry upでよいでしょうか？ >>おおさん お返事有難うございます。培地は血清ありを用いる予定でいます。 通常、分泌蛋白の濃縮には無血清培地を用いるのが一般的なのでしょうか？ 質問に質問を重ねて大変申し訳ありません。 お時間がございましたら、またご教授いただければ嬉しいです。

(無題) 削除/引用 No.1230-3 - 2008/06/01 (日) 05:43:53 - おお 硫安、TCAといった方法も取れると思いますが、、、、 バイチは無血清ですか?3ml取ってバイチ中のタンパク量(細胞が分泌した分を無視して)が期待できますか? 濃縮してもPAGEのキャパをはるかに超えていてはという心配はないのかなあと少し思います。

(無題) 削除/引用 No.1230-2 - 2008/06/01 (日) 01:14:16 - K 細胞培養上清の濃縮をアセトンで行いました。 コールドアセトン４倍量を上清に加え、-20℃で１時間以上置きます。 論文によっては終夜、ゆっくりと落としたほうがよいというものもあります。 遠心でアセトンを除去したのち室温で風乾し、その後Buffeで再溶解しますが、 この際不溶化する場合があるので、コールドエタノールで軽くリンスするのがよい 場合もあります。 私はフェノールレッド抜きの培地を用います。SDS-PAGEではさほど問題にならないはずですが、 蛋白定量、二次元ゲル電機泳動のときに妨げになるからです。 ご参考になれば幸いです。

培養上清の濃縮について 削除/引用 No.1230-1 - 2008/06/01 (日) 00:52:24 - 学部学生の初心者 いつも勉強させていただいております。 以前ここのトピックで、組織の脱脂にアセトンを用いる、とのコメントを拝見いたしました。またそのとき、蛋白の濃縮にも同じような方法が取られるとも書かれたあったような気がします。 そこで、今後私が細胞の培養上清を回収して、分泌蛋白の存在の有無をイムノブロットを用いて調べようと思っていました。当初はスピンカラムで濃縮しようと考えていましたが、コストが嵩みますし、てことを考えていたときに、アセトンを使った濃縮を思い出しました。 みなさんは細胞の培養上清をアセトンで濃縮したことはありますでしょうか？もし、ございましたらお使いのプロトコールをご教示していただけないでしょうか？よろしくおねがいします。 私は6cm dishに飼っている細胞の培養上清3 mlを、アセトンで濃縮した後、適当なbufferで再度溶解して、SDS-PAGEを行いたいと考えています。

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