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(無題) 削除/引用 No.1228-7 - 2008/06/01 (日) 09:45:25 - おお >[Re:6] 基本的質問ですみませんさんは書きました : > 皆様 > 蛋白質のマップ（パターン）を維持したまま発現量があがっている、さがっているという現象をみることができるのと...........２Dでいえば（大幅な違いはないとしても）処理によって蛋白量が「上昇する」こともあり得るのでは、と思うのですが、いかがでしょうか まず、2D全体のシグナルがよわいので、たんぱく質がそのサンプルにおいて少ないというのは観察としてはあり得ると思います。でもそれを結論づけるなら、抽出したタンパク(ライセート)のタンパク量をはかればいいわけで、実際電気えいどうにのせるためにやる作業だと思います。2D全体のシグナルはのせたたんぱく質量を反映するとは思いますが、すべてのタンパクを見ているわけでないというのもあります(pIのレンジからはずれているものとか)。 それと違ったゲルでの観察では、すべて一緒の操作をしなければなりませんね。でその比較をする時両者のスタンダダイズをどうしますか?違った日にやった物を比較する時問題が出てきませんか?たしかにサンプルにいつも一定量の特定の解析の邪魔にならないタンパクを加えてそれをインターナルこんとろーるにするというのもてですが、あまり聞かないほうほうです。 また、程度によりますがえいどうはのせるたんぱく質の量によりパターンが変わってきます。許容範囲内での2倍ぐらいの差でしたら、そんなに大きな差は生じないとおもいますが、2倍ぐらいのさをこのような系でうまく示すのは、実験誤差を見ていないかどうかというところでコントロールが難しくなってきますので結論には至らない観察にとどまることのほうが多いと思います。差がかなり大きいと前述のようにパターンの歪とか検出できるタンパクの差が大きくなり、スポットの同定が難しくなったりと2Dのメリットが失われてくると思います。 2DでもDIGEなど、ラベルを行う時は、ラベルの効率をそろえないといけないので、タンパク量をそろえてから、ラベルしないと訳が分からなくなってしまいます。

(無題) 削除/引用 No.1228-6 - 2008/06/01 (日) 05:56:03 - 基本的質問ですみません 皆様 ご意見ありがとうございます。とても参考になります。 ami様＞確かに実験中にロスする細胞数をどう考えるか、が一つだと思います。 う〜んと様＞同じ細胞数であっても確かに蛋白量は違いますね。私はヒト由来の試料を扱っているのですが、ドナー差か実験者の差によるものか悩みどころでもあります。 おお様＞総蛋白量の違いというのは２Dを想定していたのですが（言葉足らずで申し訳ありません） 蛋白質のマップ（パターン）を維持したまま発現量があがっている、さがっているという現象をみることができるのと、おっしゃるように対象の蛋白質発現量の上下を見る事の両者ができると思います。２Dでいえば（大幅な違いはないとしても）処理によって蛋白量が「上昇する」こともあり得るのでは、と思うのですが、いかがでしょうか。 　細胞によって、また実験によって細胞数を数えられるかどうか、というのは確かにそうですね。 引き続きご意見いただけると幸いです。

(無題) 削除/引用 No.1228-5 - 2008/06/01 (日) 05:30:17 - おお > 私自身は　 > 細胞数(または組織重量）を固定して泳動；そのマトリックス全体における総蛋白質の変動を含めて解析ができる。 これはどうでしょうか、総タンパクを考えるなら、タンパク量を測れば解決するのではないでしょうか。PAGEで展開してしまってから総タンパク量と言うのはやりにくいと思いますが、、、 大抵の実験は、総タンパクの変動というより、何か興味の対象がどの様に変化するか見るために(2D)PAGEなどをするのではないでしょうか。 タンパク量をそろえる理由はいろいろあると思います。例えば接着細胞を何かの処理でn=3、4ぐん比較するとして、一つずつ細胞数を数えてから、たんぱく質を得ることが実験的にできることか(手間や、細胞を数えている間の生理的な変化とか)問題になると思います。あと同じ細胞数だと思われても(同じ処理をした１ぐんのサンプルないとかでも)ライセイトをとってタンパクを測ってみると、時折結構違うことがあります。そういう実験的ぶれを防ぐためPAGEの前にタンパク量をそろえるのが普通だと思います。

(無題) 削除/引用 No.1228-4 - 2008/05/31 (土) 15:41:35 - う〜んと 細胞の大きさの変化などでタンパク質量は結構変動幅が大きくないですか？ タンパク質量が試料間で大きく異なるときれいに流れないことがあるのでタンパク質量をそろえて泳動する場合が多いと思います。 電気泳動のゲルの中に入ってこないタンパク質もあったりするので、どちらをそろえて電気泳動するにしても、タンパク質量は定量した方がいいように思います。

(無題) 削除/引用 No.1228-3 - 2008/05/31 (土) 15:10:03 - ami 実験中に細胞数が増えたり減ったりするというのをどう扱うかですが。

(無題) 削除/引用 No.1228-2 - 2008/05/31 (土) 15:08:41 - ami そういうことじゃないでしょうか。

細胞数 vs 蛋白量−電気泳動 削除/引用 No.1228-1 - 2008/05/31 (土) 14:17:10 - K 電気泳動（2D, SDS-PAGE)をする際、細胞数（または組織の重量）を固定して試料を流す場合とたんぱく質量を固定して試料を流す場合があります。それぞれ長所短所があると思うのですが、皆さんのご意見をお聞かせいただけませんか？同僚とディスカッションしていて疑問に感じました。 私自身は　 細胞数(または組織重量）を固定して泳動；そのマトリックス全体における総蛋白質の変動を含めて解析ができる。 蛋白量を固定：総蛋白質における各蛋白質の比率を求めるのに有効 よろしくお願いいたします。

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