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(無題) 削除/引用 No.1227-4 - 2008/06/01 (日) 00:58:19 - AP >ＡＰさんがご教授していただいた対処法を実行できるノウハウがありません。 PCRのスキルはもっていらっしゃるのですよね。 以前投稿があったプローブさんでしたら、今回クローニングに手こずっているインサートもPCRで準備したものでしょう？ PCRができれば難しい方法ではないです。 PCRでプロモータを付加するtipsや参考URL(Ambion)は過去トピに http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech2/biotechforum.cgi?mode=view;start=1;Code=279 asymmetric PCRでstrand specific probeを作る方法はRocheのDIG ISHハンドブックのなかにあります。 外注の納期や費用がどれくらいかかるか知りませんが、上記の方法では、せいぜいプロモータ付きのプライマーあるいはDIG-DNA label用のdNTP mixを買い足せばよくて、あとはPCRするだけなので費用も時間もセーブできると思います。

(無題) 削除/引用 No.1227-3 - 2008/05/31 (土) 23:11:37 - プローブ ＡＰさんありがとうございます。 当方は最近実験を始めたところでして、単に勉強不足といわれればそれまでですが、ＡＰさんがご教授していただいた対処法を実行できるノウハウがありません。 私ができるとすればプローブの設計をやり直すくらいになります。

(無題) 削除/引用 No.1227-2 - 2008/05/31 (土) 12:45:53 - AP 外注先の情報ではないですが、 ＞in situ hybridization用のDIG-RNAプローブを作っていますが、いままで問題なくできていたのですがなぜか今回はなかなかうまくいきません（大腸菌クローニングの段階で）。 私も経験がありますが、おそらくインサートがleakyに転写され、大腸菌に毒性のタンパク質が発現してしまっているのだと思います。 考え得る対処法としては、 ・インサートの向きが逆になるようにデザインする（両側にファージプロモータがあってこれが効いている場合はだめかもしれませんが、lacZの転写に依存して発現しているならこれで解決する可能性あり）。 ・ファージプロモータ配列をtailにつけたプライマーで目的のDNA断片をPCRで増幅して、in vitro transcriptionの鋳型にする。 ・asymmetric PCRで一本鎖DNAプローブをつくる（精製したPCR産物に対して片側だけのプライマーを投入し、PCRの要領で反応させる過程でラベルを取り込ませる）。

in situ hybridizationのプローブ注文 削除/引用 No.1227-1 - 2008/05/31 (土) 07:16:54 - プローブ in situ hybridization用のDIG-RNAプローブを作っていますが、いままで問題なくできていたのですがなぜか今回はなかなかうまくいきません（大腸菌クローニングの段階で）。 時間もなく値段的に折り合いがつけば外注も考えております。 そこでどなたかよい会社があれば教えてください。また値段はどの位するものでしょうか？

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