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(無題) 削除/引用 No.1206-8 - 2008/05/31 (土) 20:58:02 - a 既に指摘されているようにBL21は発現するときに使用するものです endA+,recA+ですと遺伝子が抜け落ちたり、精製したplasmidが分解されたりし易いと思います（フェノクロ処理を即座にすれば大丈夫ですが）。 あと、気になるのは、「形質転換されていると思われるコロニーは10％くらいの割合で得られました」というところです。90%はベクターのセルフライゲーションということですか？コロニーの個数にもよりますが、あまりに多いというのであれば、ベクターの処理方法に問題があるようにも感じますが・・・。 私の経験では、BAP/ゲル回収を行ったvectorでセルフは10個程度、positiveは500〜1000個近いです。 それと、インサートがXhoI-XhoIのフラグメントですと、インサート自身のセルフライゲーションが増えますので、positiveクローンの割合はかなり激減します。さらに、逆向きのクローンも取れてきますのでチェックが面倒です。可能であれば2種類の酵素サイトを仕込むが良いですよ。

(無題) 削除/引用 No.1206-7 - 2008/05/29 (木) 02:17:48 - おお >[Re:3] SUBさんは書きました : > 回答ありがとうございます。 > 大腸菌はE.coliBL21を使用しています。 まず一番可能性のある原因は大腸菌の株だと思います。 BL21系の株は他の方が仰ってますように普通のプラスミド構築の作業に向いていません。 プラスミドを作る作業は従来その目的で使うK株を使用することをおすすめします。 例えば有名な株はJM101、JM109、DH1、DH5alpha、XL1Blue、Top10、Sure、XL10-Gold、(HB101)などです。PCRベースなのでフラグメントにメチレーションが施されていませんが、とてつもなく長いわけでもありませんので細かい考慮はなくても大丈夫だと思います。でもそれぞれの株がどのような特徴があるかは、今後色々なプラスミドを作るうえで参考になると思いますので、時間のある時にちょっとずつその内容を見ていくと良いと思います。 http://www.promega.co.jp/cat/cat19.pdf タカラ、NEBとかほかの会社もこの手もものをホームページなどで公開してます。確か日本ジーン(だったかな、ちょっと記憶に自信がないですが)に丁寧な解説を見たことがあったような気がします。

(無題) 削除/引用 No.1206-6 - 2008/05/28 (水) 18:10:00 - AP ＞バンドはまったく検出されませんでした。 ベクターのバンドもということでしょうか、ベクターのバンドは出たけれどインサートが無かったということでしょうか（状況を過不足無く記述する能力って、実験技術と同じくらい大事ですよね）。 プラスミドを精製して調べてみたらスカだったということから、一番可能性があると思うのは、コロニーPCRでポジティブだったのはライゲーション反応液からの持ち込み、精製プラスミドのPCRでポジティブだったのはコンタミであるという結論だと思います。 いままでも、たびたび論議されていたように、PCRでインサートを検出するとき、インサートの配列のプライマーを使うと、菌と一緒にspreadされたligation反応液中のフリーのインサートを増やしてしまうのであてになりません（少なくとも一方はベクター配列のプライマーにすべきです）。 それでは精製プラスミドのPCRでポジティブというのは説明しにくいですが、直前にインサートを増やすためのPCRをやっていたでしょうから、実験環境にPCR産物の濃厚汚染が起こっていたというのは想像に難くありません。 なにしろ今ある結果の中で、精製したプラスミドの分析ほど信頼のおける証拠はないですから。 他の方が指摘されるように、まれにインサートの入ったプラスミドが嫌われることがあって、培養しているうちにインサートが抜けたものが増えてくるってことがありえるにしても、その低い可能性を疑ってじたばたするより、まずは素直に実験デザインがまずいのでは？と見直すべきでしょう。 例えばコロニーPCRや精製したプラスミドのPCRでインサートをはさむベクター配列のプライマーでPCRをしたとき、インサートのサイズの産物がでるでしょうか。難しい論議はそのあとです。

失礼しました 削除/引用 No.1206-5 - 2008/05/28 (水) 17:24:32 - メタボリック PCRはゲノムを鋳型に行われたんですね。私の３番目のコメントは次のように読み替えてください。 得られたプラスミドがpET15-bと基本的に同じ形状をしていることは確認されましたか？BglIIや、NdeI、BamHIサイトは残っていますか？

(無題) 削除/引用 No.1206-4 - 2008/05/28 (水) 16:31:24 - メタボリック 「形質転換されていると思われるコロニーは10％くらいの割合で得られました」という場合の10％は、何に対する何の割合ですか（分母は何の数で分子は何の数ですか）？ 「バンドはまったく検出されませんでした」とのことですが、「まったく」というのは複数の形質転換体に由来するプラスミドが全て見かけ上同じサイズで、いずれもXhoIで切断されなかった（or 1-cutだった）ということでしょうか？何クローン確認されましたか？ 得られたプラスミドがpET15-bに由来する（基本的に同じ形状をしている）ことは確認されましたか？PCRの鋳型に使ったプラスミドが回収されているのではありませんか？ それから、一般にBL21株はプラスミドの構築には不向きなので、XL10-GoldやDH10Bなどの株を用いてまずプラスミドを構築し、しかる後にBL21に形質転換し直す場合が多いようです。

(無題) 削除/引用 No.1206-3 - 2008/05/28 (水) 15:10:41 - SUB 回答ありがとうございます。 大腸菌はE.coliBL21を使用しています。インサートの長さは500bpです。目的断片であることは別の実験でシークエンスを行って確認済みです。形質転換されていると思われるコロニーは10％くらいの割合で得られました。ベクター内の配列を用いてのPCRは行っていません。実際に抽出プラスミドをxho�Tで処理したところ、バンドはまったく検出されませんでした。シークエンスに関してはゲノムPCRを行ったものと同じプライマーを使いました。 情報足らずですいません

(無題) 削除/引用 No.1206-2 - 2008/05/28 (水) 14:38:24 - おお 差支えのない範囲で、もう少し細かい情報を提示される方がいいと思います。 >[Re:1] SUBさんは書きました : > 今回目的遺伝子をゲノムからPCR増幅し、pET15-bプラスミドのXho�Tサイトに挿入し、それを大腸菌に形質転換して組み替え体を作りました。 Xho1サイトにどのようにいれたか(Xho1サイトにブラントで入れのかとか)?インサートはどれぐらいの長さか?PCRフラグメントを切断して電気へいどうで切断が確認できるような酵素を使い、それがスペシフィックなPCRプロダクトか確認したか。どれぐらいの割合でコロニーができ、そのグロースの早さはどうであったか?コンピの菌株めいは? > きちんと入っているかを確認するため、コロニーPCR、またプラスミドを抽出しPCRを行うと、バンドは検出さます（このとき使ったプライマーはゲノムから目的断片を増幅したときに使ったものと同じ）。 ころにーPCRの時どれくらいの割合でポジテブであったか。ベクター内の配列をプライマーにするとPCRが掛かるか? > しかし抽出した組み換えプラスミドをXho�Tで処理し、電気泳動を行ってみても挿入された断片と思しきバンドは検出されませんでした。 実際どんなバンドが得られたか(切れなかった、ベクターより大きかったetc)?インサートとベクターの長さが近くてうまく分けれなかった可能はないか?インサードが小さいにもかかわらず十分なDNAが乗ってない可能性はないか? > > シークエンス解析は行いましたがきちんとした波形データは得られませんでした。 シーケンスはどこをプライマーにつかったか? 上記質問は解決を考えるキーになる可能性があります。何を言わんとしているか考えてみると解決方法が見つかるかもしれません。 大腸菌よう発現ベクターは意外と不安定であることが結構あります(T7polなくても)。トランスフォーメンションようプレイトのこうせい物質の量を半分ぐらいに減らして(pBR oriのようなので10ug/mlぐらいとか)30度ぐらいでインキュベーションする。 などの工夫で大腸菌ないのプラスミドのコピー数をなるだけ抑えて、プラスミドの大腸菌に与える悪影響をおさえる。トランスフォーメーションのプラスミドを極力下げて、多種のプラスミドが一つの大腸菌の中に入るのをさける。という工夫でうまく行くことがあります。 と言うのはPCRがかかるということから一端目的のプラスミドが大腸菌内でできたが、大腸菌がきらって、部分的な欠出とか起こったりして、実際増えてきたのは異常なプラスミドという可能性があるからです。こういう場合は精製プラスミドからPCRで増やすと欠出するまえのプラスミドが微量残ってってかかってしまうこともあるかもしれません。 あとこれはないと思いますけどPCRの系がコンタミしている可能せいは否定できますが?例えばあなたのPCRでネガコンは取ってますでしょうか?何をネガコンにしているでしょうか。

組み換えpET15-bプラスミドについて 削除/引用 No.1206-1 - 2008/05/28 (水) 13:37:41 - SUB 今回目的遺伝子をゲノムからPCR増幅し、pET15-bプラスミドのXho�Tサイトに挿入し、それを大腸菌に形質転換して組み替え体を作りました。きちんと入っているかを確認するため、コロニーPCR、またプラスミドを抽出しPCRを行うと、バンドは検出さます（このとき使ったプライマーはゲノムから目的断片を増幅したときに使ったものと同じ）。しかし抽出した組み換えプラスミドをXho�Tで処理し、電気泳動を行ってみても挿入された断片と思しきバンドは検出されませんでした。 シークエンス解析は行いましたがきちんとした波形データは得られませんでした。 いったいどのような原因が考えられるのでしょうか？意見のほどをよろしくお願いいたします。

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