全10件 ( 1 〜 10 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

アドバイスありがとうございました 削除/引用 No.1203-13 - 2008/05/30 (金) 02:16:03 - 渡加２週間 通りすがり様、B様、AP様、ご回答の程ありがとうございました。 ＞通りすがり様、B様 確かに精製を目的とした場合、培養細胞を用いるとご指摘の通りコストとテクニック的な問題が発生しかねません。手をつけられるところから試すことが必要かもしれません。ボスと交渉してみます。 ＞AP様 検証事例を探して下さり誠にありがとうございました！　菌体とベクターの組み合わせばかり考えていたので、菌体そのもののについて考えることを失念していました。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1203-12 - 2008/05/29 (木) 17:50:23 - AP こういうとき、他の研究者はどうやってるのだろうと思ってちょっと調べてみましたら、私は知らなかったのですが、 BL21(DE3)から生じたmutant strain C41(DE3)やC43(DE3) がよく使われているみたいですね。 原著の要旨をざっと読むと、いろいろなタンパク質発現ベクターを試したうち、 6割が毒性のためBL31(DE3)ではtransformation不能であったところ、 mutantではすべてtransformantが得られたとか、 誘導したときの発現レベルもmutantのほうがおおむねよかったというようなことが書いてあります。 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8757792 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15294299 市販もされていて、日本国内ではコスモバイオやフナコシに取り扱いがあるようです。

(無題) 削除/引用 No.1203-8 - 2008/05/29 (木) 16:35:27 - B 変異体の実験には使えませんし実際の組織中の発現量が わかりませんがもし目的の膜蛋白質がヒト以外の動物の 組織で多量に発現していることがわかっているのであれば 発現系を構築するよりも例えばウシの組織などを買ってきて そこから精製して初期の実験に使うという手もあるかも 知れません。

(無題) 削除/引用 No.1203-7 - 2008/05/29 (木) 10:49:46 - 通りすがり 動物細胞なら膜蛋白でもうまく発現する、という保障はありません。 今現在、動物細胞発現系を使っているならいいですが、 新しく立ち上げるとなると細胞培養そのもののスキルなどいろいろ問題が出てくるかもしれません。 まずは大腸菌で試してみて、具体的な問題が出てきてからアドバイスを受けるというのもいいのではないでしょうか？

ありがとうございます 削除/引用 No.1203-6 - 2008/05/29 (木) 06:03:57 - 渡加２週間 AP様、緑様、 ご提案・ご回答の程ありがとうございました。少なくとも、可溶性タグが無いと大腸菌発現では厳しいようですね。。。　膜タンパク質(勿論ものによりけりですが)は収量を無視すれば、動物細胞を使った発現から始めるのが無難なのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1203-5 - 2008/05/29 (木) 00:54:24 - 緑 たぶん（＞95％？）だめでしょう。大腸菌は外来疎水蛋白は大嫌いです。 低コスト・高収量は矛盾した試みかもしれません。結合実験で、なぜそれほど大量に必要なのがよくわかりませんけど、機能実験なら必要なことありますね。 以上、一般論で、例外はあるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.1203-4 - 2008/05/28 (水) 22:52:04 - AP 疎水性タンパク質に特別に適しているという宿主・ベクター系があるのかどうかしりません。封入体になるか、可溶性になるかも発現量や発現速度の影響が大きく、あまり親水性・疎水性には関係ない印象です。 それより、あまりに疎水性が強くて、アッセイするとき反応液中に溶けてくれないようでは、万事休すですよね。 私が、提案するのは、GSTやMBPのような親水性が高くサイズの大きいタグと融合して親水性を高め、なるべく封入体を形成しないように培養条件をコントロール、in vitroのbinding assayには不溶化しないようにタグをつけたままやる（pull-down assayするにも便利だし）。タグを切り離したとたん不溶化して沈殿するタンパク質も珍しくないですから、そんなに疎水性の高いタンパク質はその危険が高いと思います。 実際のところ、タンパク質の発現は、やってみないとどうなるかわかりませんけれど。

膜タンパク質です 削除/引用 No.1203-3 - 2008/05/28 (水) 21:45:59 - 渡加２週間 おお様、お答えありがとうございました！ 質問の情報が少なく、申し訳ありませんでした。 ・目的のタンパク質；２種類とも膜タンパク質(細胞膜)です。 ・大きさ；45kDa、20KDaです。 ・実験目的；精製後にin vitroで他の物質に対する結合実験を行う予定です。測定系が大きいので、数百ug〜mg単位の量を用意できるとベストです。 ・WTで結果が得られた後、疎水部分にsite-directed mutagenesisを行いタンパク質精製後、同じように結合実験をしたいと思っています。 細胞内タンパク質しか精製したことが無く、どうしたらよいのか迷っています(資金面の事情からあまり色々試せない為)。どうか宜しくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.1203-2 - 2008/05/28 (水) 09:42:00 - おお まず、そのタンパクは膜タンパクなのかとか、どのような目的で使うのかとかある程度情報を公開した方がより多くの答えが得られると思います。大腸菌の中でガンガンに発現してやると、インクルージョンボディーに大量に取り込まれることがかなりあるので、構造や活性など無視できる時はそれでも良いかも知れません。 もし膜タンパクなら膜に移行させた方がいいでしょうが、高い発現量が得られるかは微妙です。ですから、疎水性の高いタンパクといっても、どんなタンパクかとか、高い発現といってもどの程度かによって取る方法が変わってくると思います。

疎水性タンパク質の発現・精製 削除/引用 No.1203-1 - 2008/05/28 (水) 02:23:08 - 渡加2週間 ２種類のタンパク質を発現、精製したいのですがどちらも疎水度が高いのです(タンパク１：疎水度50%・親水度30%、　タンパク２：疎水度40%・親水度40%)。 出来るだけ低コスト・高収量を目標としているので、大腸菌発現を考えています(Glycosylationの必要はありません)。どなたか高疎水性タンパク質の発現に適した大腸菌・ベクターを教えていただけないでしょうか。 或いはその疎水度ならば動物細胞発現系でなければ無理、といったご指摘がありましたらその際適した系など教えていただけると幸いです。宜しくお願い申し上げます。

全10件 ( 1 〜 10 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---