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(無題) 削除/引用 No.120-10 - 2007/09/08 (土) 14:53:15 - Winter8 >>ＯＤ６００＝０．７ もっと低い（0.5以下）方がいいんじゃないでしょうか？ 培養時間もケースバイケース。2時間毎に1mlぐらいずつサンプリングして、SDS-PAGEで確認すれば簡単に比較できるので一度やってみたら。

なるほど 削除/引用 No.120-9 - 2007/09/07 (金) 21:07:10 - 実験初心者 皆様アドバイスありがとうございます． 封入体可溶化のアドバイスを下さった皆様には申し訳ないですが，使用目的上やはり変性はあまりよろしくなく，refoldingも自信がないので，可溶化の条件を探すことにし，とりあえず温度を１８℃〜２０℃まで下げて誘導を試みることにいたしました． するとほんとに少しですが，可溶化したようです！ 約２０℃，ＯＤ６００＝０．７まで培養しＩＰＴＧ（０．１ｍＭ）添加 ２４時間後に集菌という条件です． このままボリュームアップして回収してしまおうと思うのですが， もっと良い条件があるのかとちょっと気になります． 少し気になる点なのですが，ＩＰＴＧ添加後２４時間培養というところなのですが，もう少し長いほうがよい（あるいは短いほうがよい）など，もし経験がある方がおられましたら，今後の実験計画の参考にしたいと思いますので，アドバイスをいただけたらうれしく思います．

アルギニン塩酸塩 削除/引用 No.120-8 - 2007/09/07 (金) 16:35:47 - tak 1-2Mのアルギニン塩酸塩を含むバッファーで封入体の洗浄を行うと、可溶性のタンパク質を得ることができるという論文を見たことがあったと思います。 その論文ではGFPを可溶化させていたと思いますが。

(無題) 削除/引用 No.120-7 - 2007/09/04 (火) 20:49:29 - a 私が知る限りでの情報ですが、 大腸菌シャペロンのシステムは、上手く可溶性になればラッキーというくらいです。特に、可溶性画分にも存在するが不溶性にも存在しているという場合は良いかもしれません。しかし、完全に不溶化しるものですと厳しいのかもしれません。 ただ、時間に余裕があればどの幾つかのシステムを試してみるのが良いのかもしれませんね

(無題) 削除/引用 No.120-6 - 2007/09/04 (火) 16:48:38 - Ｔ 大腸菌と同じメカニズムかどうかは知りませんが、バキュロでも inclusion body になる事はありますよ。 シャペロンを同時に発現する事が、場合によっては封入体の解消に有効というのも大腸菌と似ています。 （例えば http://bio.takara.co.jp/catalog/catalog_d.asp?C_ID=C2090 ） 哺乳動物細胞の場合は、通常用いられる方法では大腸菌やバキュロに比べて発現量が桁違いに低いので、あまり問題にならないのでしょう。

(無題) 削除/引用 No.120-5 - 2007/09/04 (火) 16:12:13 - A >[Re:3] ともさんは書きました : > この前あるメーカーがきて、私に話をしてくれたのですが、理由は不明な >のですが、バキュロの発現系を使うと不溶性分画にいかずにちゃんとタンパ >ク質とれるらしいです。あとはシャぺロン持っているコンピ使うこともおす >すめします。ストラタジーンやTAKARAにコンピ売ってます。不溶性が可溶性>になるらしいですよ。実際には試していませんが。 真核生物（バキュロや哺乳類培養細胞の発現系など）では大腸菌のような 封入体のシステムが無いので、上手く合成されない蛋白質は分解されて しまう。そのため発現が見られればフォールディングは上手くいっている と私は認識してましたが違いますか？

(無題) 削除/引用 No.120-4 - 2007/08/30 (木) 15:31:58 - うーん バキュロもシャぺロンを発現させた大腸菌も、「可溶性に発現できることもある」くらいに取っておくべきだと思いますよ（バキュロは面倒な分くらいはマシかもしれませんが）。その矛でその盾を突いたらどうなるかと問われて返答に窮したのも「メーカー」ですから。

(無題) 削除/引用 No.120-3 - 2007/08/30 (木) 14:50:18 - とも この前あるメーカーがきて、私に話をしてくれたのですが、理由は不明なのですが、バキュロの発現系を使うと不溶性分画にいかずにちゃんとタンパク質とれるらしいです。あとはシャぺロン持っているコンピ使うこともおすすめします。ストラタジーンやTAKARAにコンピ売ってます。不溶性が可溶性になるらしいですよ。実際には試していませんが。

(無題) 削除/引用 No.120-2 - 2007/08/28 (火) 18:29:38 - a inclusion bodyと思いますが。 不溶性蛋白を尿素や塩酸グアニジンで可溶化することはあります。 GST fusionですので、refoldingさせないとグルタチオンに結合しません。 このrefoldingが曲者です（上手くできないものはどうやっても無理です）。 ただ、非常に高発現している場合、inclusion bodyを精製すれば、ある程度の純度はあることもあります。ですので、殆ど精製しなくても良いこともあります。 蛋白質精製の目的にもよりますので、慎重に検討された方が良いと思います。他のタグに変えてみるとか、できる限り可溶化したもので発現させた方が良いですよ。

大腸菌不溶性画分からのタンパク質回収 削除/引用 No.120-1 - 2007/08/28 (火) 13:37:48 - 実験初心者 ＧＳＴ融合タンパク質を大腸菌で発現させようとしています． ＩＰＴＧの濃度を低くしたり，温度を２５℃まで下げるなど条件を変えてみたりしたのですが，どうしても不溶性画分に行ってしまいます． そこで，不溶性画分からタンパク質を回収しようと思うのですが，市販のlysisバッファー（できれば使いたくないすが）や自作プロトコルでおすすめはありませんか？ ちなみに１％TritonX-100中で超音波破砕をしてもほとんど可溶化しませんでした．しかし，SDS-PAGEサンプルバッファー（２％ＳＤＳ）中では十分可溶化し，大きなバンドが見られます．（ということはインクルージョンボディではないということでしょうか？）　 勉強不足ですがよろしくお願いします．

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