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(無題) 削除/引用 No.12-5 - 2007/09/24 (月) 10:50:39 - まつ M様、 結合タンパク質同士の解析でも多段階の免疫沈降が必要な場合が多いので、 もうワンステップの精製過程をいれるアイデアがあるといいと思います。 たとえば、DNA側の標識にはマイルドな条件で外せるタグを付ける。ちょっとアイデアがありませんが。 もしペプチド等が付与できるなら、プロテアーゼサイトでもいいかもしれませんが（TEVとか）。 一回目の精製をそのアフィニティーで行い、その後、例えばガラスビーズのようなDNAのみを吸着するようなカラムで精製するとか。 ちょっと今思いついただけなので実現可能かわかりませんが、そのようなアイデアがあれば銀染でも特異的バンドが期待できるのではないかと考えます。

(無題) 削除/引用 No.12-4 - 2007/08/01 (水) 10:59:49 - M やはりノンスペをなくすというのは難しいんですね…。 実験の目的は、既知のDNA binding proteinに結合してくる未知のタンパクをMS解析しよういうものです。ですから、ノンスペバンドには非常に悩まされています。 DNA binding proteinそのものが、この実験系で落ちてきていることは、WBで既に確認しています。しかし、細胞内でのもともとの発現が少ないせいか、銀染色では、ノンスペバンドに紛れてしまって見えないのです。 実験を始めてまだ日が浅いものですから、よい対処法が思いつかず、皆様のご意見を伺えたら、と思っています。

(無題) 削除/引用 No.12-3 - 2007/07/31 (火) 18:31:04 - a DNA binding proteinを捕まえたいということですよね。 ストレプトアビジンアガロースビーズは使用したことはありませんが、ラテックスビーズを用いた時、非常にノンスペが多く困りました。 通りすがりさんと同じで１回のプレクリアでは殆ど変わらず。そこで、量と回数を増やしたところ、今度は殆どの蛋白質が吸着してしまいました。 Mさんは既知の蛋白質を見る予定ですか（ウエスタンで）？それとも、未知のものですか？もし、未知の蛋白質を捕まえMSで同定とかなされるのなら、そのままのシステムでは厳しいとおもいます。既知のものならノンスペが多くてもポジとネガで異なれば良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.12-2 - 2007/07/30 (月) 23:20:27 - 通りすがり ストレプトアビジンマグネットビーズを使って同じようなことをしてましたが、私の場合はプレクリアを増やしてもほとんどノンスペバンドは減りませんでしたが親水性ビーズを使うと若干ノンスペが減りました。商品名は失念しましたが、ダイナビーズだったと思います。 タンパクの溶出の際に熱処理するとビーズにくっついてるのが根こそぎはがれてくるので、EDTAやヌクレアーゼなどで切り離すなど、溶出条件を工夫すると改善されるのではないでしょうか。

ノンスペバンドとプレクリア 削除/引用 No.12-1 - 2007/07/30 (月) 14:47:50 - M ビオチン標識オリゴヌクレオチドとストレプトアビジンアガロースビーズを使って、あるDNA配列に特異的に結合するタンパク質およびその複合体を取ってこようとしています。 電気泳動したゲルを銀染色して見ているのですが、ノンスペのバンドが多くて困っています。このノンスペのバンドはオリゴヌクレオチドではなく、ビーズ由来のものであることはわかっています。このような場合、プレクリアの段階で、アガロースゲルの量を増やせば、ノンスペのバンドは完全に消えるのでしょうか？それともそのような単純な話ではないのでしょうか？ washは可溶化バッファーと同じもので三回行っています。タンパクの複合体を見たいので、washの条件をあまり厳しくしたくないと考えています。 このような経験のある方がいらっしゃれば、アドバイスをお願いいたします。 おおまかなプロトコル whole cell lysateにストレプトアビジンアガロースゲルを加えてプレクリア ↓ 上清にビオチン標識オリゴヌクレオチドを加える ↓ ストレプトアビジンアガロースゲルを加えて、DNA結合タンパクを落とす

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