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(無題) 削除/引用 No.1187-3 - 2008/05/23 (金) 13:37:09 - おお APさんの言うようにある種ぼんやりとした制約があります。くり返し配列や、ホモロジーのたかい配列がゲノムとか、ESTにあるやつは避けた方がいいと思います。 あとはAPさんの繰り返しになりますが、スプライシングなどのアイソフォームをどうカバーするのか、あるアイソフォームを特異的に見るのかでプローブの位置が変わってきます。 加えてアンチセンスがわから何か転写されてないかという問題がたまに起きます。とくに、最近はタンパクを持たないRNAが注目されていますし、、、。そういう意味ではRNAプローブの方がいいのですが、RNAの場合は少し扱いが面倒です。ですからDNAプローブではじめるのがいいかと思います。 もし、cDNAをプラスミドでおもちで、さほどアイソフォームの心配をしないでいいならインサートを切り出して、ランダムプライマーを使ってラベルしてみれば良いと思います(キットが出回ってます)。プローブの長さは500b以上ぐらいで、2個所或いは制限酵素で前半と後半をわけて2種類のプローブでやるようにすれば、予測できない理由で、検出がうまくいかないという事態を回避できると思います。

(無題) 削除/引用 No.1187-2 - 2008/05/23 (金) 08:19:20 - AP ＞mRNAと相補的な配列の1本鎖または２本鎖のDNAかRNAを合成して標識をつけるということでよろしいのでしょうか？ DIG標識プローブとAP/CDP-Starで感度としては十分です。これで検出できないようだと、RIに切り替えてもやっぱり難しいです。 いろいろな方法がありますが、まずは、Random prime label (DIG High Prime)による二本鎖DNAプローブが、簡便でコンスタントな結果が得られるのでいいと思います。 PCRによるDNAラベル、in vitro transcriptionによるRNAラベルでは、良いプローブができるかどうかは、鋳型の配列や長さを選ぶので、どうしてもそれでなくてはならない理由がなければ避けた方が無難です。 ＞配列に何か注意することとかありますか。こういう配列のところははダメとかありますか splice iosformsをもれなく検出しようとしたら、バリエーションの生じやすい5', 3' 末端付近は避けた方がいいでしょう。 塩基配列から判断するなら、極端にAT-richとかGC-richであるとか、特定の塩基が長く連続しているような単純な配列は避けた方がいいだろう、くらいのことはいえると思います。 一番いいのは、同じプローブでゲノムサザンをやってみて、プローブ領域を含む断片だけが特異的に検出されることを確かめてからやることです。 ゲノム配列情報だけからユニークなプローブを選んでも、ホモロジー検索で引っかからなかったような短い相同配列が、目的外の転写産物を検出してしまうことがあるからです。

ノーザンブロット 削除/引用 No.1187-1 - 2008/05/23 (金) 00:31:56 - 東西南北 今度、はじめてノーザンブロッティングをすることになりました。それでプローブを作成したいのですが、基本的に、他の類似の遺伝子と似ていない部分を選んで、mRNAと相補的な配列の1本鎖または２本鎖のDNAかRNAを合成して標識をつけるということでよろしいのでしょうか？配列に何か注意することとかありますか。こういう配列のところははダメとかありますか。また標識が種類とかつける場所とかいろいろあるのですがDIGとかでいいのでしょうか。 よろしくお願いします。

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