全8件 ( 1 〜 8 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.1179-8 - 2008/05/23 (金) 00:59:46 - おお >[Re:6] Ｔさんは書きました : > もうひとつ質問が。。。 > > もしかするとb-gal発現のベクターがインターナルコントロールベクター候補として使用できるかも出来ないのですが、その場合どうやってfirefly luciferaseとb-galを同じサンプルで検出しようか考えています。 > > 現在、プロメガのDual-Luciferase Reporter Assay Systemを使用しているのですが、これに付属のlysis bufferで調整したサンプルを用いてb-galアッセイできるキットをご存知の方おられませんでしょうか？ > > お教えいただければ幸いです。 http://www.promega.com/catalog/catalogproducts.aspx?categoryname=productleaf_295 プロメガのキットです。 β-Galactosidase Enzyme Assay System with Reporter Lysis Buffer 最近はこの手の実験をしないのでプロメガがどんなLYSIS BUFFERを使っているかとか情報にうといので、てもとのプロダクトマニュアルやホームページFAQなど一度見られると良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.1179-7 - 2008/05/23 (金) 00:46:34 - おお > > 一つ一つプロモーターを試すしかないのしょうね。 > お金と時間の許す限り、試したいと思います。 レポーター遺伝子(あなたのためしたいpGLのプロモータールシフェラーゼコンストラクト)を細胞にステイブルに導入して、その細胞で比較すると、トランスフェクションのインターナルコントロールを取らなくても比較ができますよ。

(無題) 削除/引用 No.1179-6 - 2008/05/22 (木) 17:20:00 - Ｔ もうひとつ質問が。。。 もしかするとb-gal発現のベクターがインターナルコントロールベクター候補として使用できるかも出来ないのですが、その場合どうやってfirefly luciferaseとb-galを同じサンプルで検出しようか考えています。 現在、プロメガのDual-Luciferase Reporter Assay Systemを使用しているのですが、これに付属のlysis bufferで調整したサンプルを用いてb-galアッセイできるキットをご存知の方おられませんでしょうか？ お教えいただければ幸いです。

(無題) 削除/引用 No.1179-5 - 2008/05/22 (木) 17:13:36 - Ｔ 皆様、貴重な情報ありがとうございます。 ^様、 ＞＞ある目的転写因子とpGL3の組み合わせで、大量のFirefly luciferaseが発現するために、そちらに材料が喰われてRenillaの発現が落ちているというわけではないのですよね。 今回の場合はそうではないようです。というのも、ポジコンとして用いた転写因子はさらに大量のFirefly luciferaseが発現してもRenillaの発現は安定していましたので。 ほとんどやられていない転写因子なので、プロモーターアッセイの論文が少なく、また、プロモーターアッセイしている論文でもタンパク質量をインターナルコントロールにしているものでした。 一つ一つプロモーターを試すしかないのしょうね。 お金と時間の許す限り、試したいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1179-4 - 2008/05/22 (木) 12:36:03 - おお 私は大昔ですがpCH101をつかってました。LacZがSV40で発現するようになっています。今どこで扱っているかとは分からないのですが、、、、TKでと言う事なのでSV40に変えるのもてかなと思いますし。ただ、これpBR系のプラスミド何ですよね。大腸菌あたりのコピーナンバーが少ないので精製の収量は落ちると思います。 pGL2を使っていて、pGL3が出た時ぐらいの話です。実際にpCH101を使ってルシフェラーゼあっせいのインターナルコントロールを取っている論文は可也そのころあったと思います。

(無題) 削除/引用 No.1179-3 - 2008/05/22 (木) 11:56:12 - ats 使ったことが無いけど、pGL4.74[hRluc/TK]は転写因子結合サイトが減らしてあるそうです。 http://www.promega.co.jp/Cre_Html.php?pGMPID=1010011

(無題) 削除/引用 No.1179-2 - 2008/05/22 (木) 11:45:46 - ~ pGL3を入れていない、pRL-TK＋pcDNA-目的転写因子と、pRL-TK＋pcDNA(ヌル)で比較しても、Renillaの発現が落ちるのですよね。 ある目的転写因子とpGL3の組み合わせで、 大量のFirefly luciferaseが発現するために、 そちらに材料が喰われてRenillaの発現が落ちているというわけではないのですよね。 >どなたか安くて良いベクターご存じないでしょうか？ この場合のいいベクターかどうかは、目的を満たすかどうかですので、 書かれていない転写因子に反応しないプロモーターのお薦めは出てこないと思いますが… 目的の転写因子でのプロモーターアッセイの論文がなく、 使えるコントロールのプロモーターは分からないのですよね。 そうであれば、1個の次のプロモーターを買って試してみても使えるか分かりませんので、 使えるプロモーターをスクリーニングしたほうがいいと思います。 pRL-basic に手持ちのプロモーターをいろいろと入れてみて、 目的の転写因子が影響しないものをスクリーニングしてはいかがでしょうか。 安くというのであれば、pRL-TKのプロモーター部分を除けば、 ベクターは買わなくて済みます。

レポータージーンアッセイのベクター 削除/引用 No.1179-1 - 2008/05/21 (水) 19:22:43 - Ｔ 長文ですがよろしくお願いします。 最近、レポータージーンアッセイを始めました。 アッセイ系としては、 ・pcDNA+目的転写因子 ・pGL3+目的プロモーター ・pRL-TK を一緒にトランスフェクションして、目的転写因子の発現が目的プロモーターにどう影響するか調べています。 トランスフェクション効率を見るために、pRL-TKのRenilla luciferaseの発現を見ているのですが、ある目的転写因子（Ａ）の発現のときだけ、他に比べてRenilla luciferaseの発現が大幅に減少します（1/20くらいに）。すべてのプラスミドを精製しなおしやり直したのですが、同じでした。 可能性としてその目的転写因子（Ａ）がpRL-TKのプロモーターに影響していることが考えられます。そこで、pRL-TKを別のプラスミドに変更しようと思っているます。プロメガの他のベクターpRL-CMV、pRL-SV40も考えているのですが、値段が高い気がします。 どなたか安くて良いベクターご存じないでしょうか？ 出来ればRenilla luciferaseベクターがいいのですが、b-galとかでもＯＫです。その場合、使用しているキットの組み合わせ（Luc用とb-gal用）も教えていただければ幸いです。 何か情報がありましたら教えていただきたいと思います。

全8件 ( 1 〜 8 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---